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标题: 【求助】怎样做到PCR的热启动！ [打印本页]

作者: tie8 时间: 2015-9-4 17:27 标题: 【求助】怎样做到PCR的热启动！

手动热启动法：
通常是先加模板DNA，再加入冰上预冷的Buffer、MgCl2、dNTP和ddH2O，接着将正反引物加到PCR管壁上（不使引物沉到管底），打开PCR仪，预热到80度，再加Taq酶到PCR管壁上，10000rpm甩5秒，立即放如预热的PCR仪上，开始循环。
热启动技术有很多产品，如（1）Taq酶在蜡块中，加热到94度，蜡块溶解Taq酶进入反应系统（2）Taq酶-Taq酶单抗复合物，94度10分钟灭活Taq酶单抗，使Taq酶发挥作用。可是以上的产品均较贵，反正我用不起。而又要防止非特异性产物。
根据Invtrogen手册的一张图谱，手动热启动法的效果与Platinum Taq酶（有单抗）相当。

作者: 8964357 时间: 2015-9-4 17:28

没作过，供参考
先加好除Taq外的组分，混匀，常规加覆液体石蜡；在PCR仪或水浴中加热至80℃，然后再加酶按部就班的进行。

作者: dior 时间: 2015-9-4 17:29

cuturl('http://www.jiansuo.net/cgi-bin/ut/topic_show.cgi?id=24782&h=1#115207')
前不久刚讲过，供参考。Big Smile

作者: xyw5 时间: 2015-9-4 17:30

i thind the product of PCR is little short may be better than too long. it is better between 200-500 bp.

作者: 8964357 时间: 2015-9-4 17:31

QUOTE:

原帖由 xyw5 于 2015-9-4 17:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

i thind the product of PCR is little short may be better than too long. it is better between 200-500 bp.

但是也要考虑到跑胶照相的问题，
200bp左右的带边缘就发虚了，
而且条带亮度是和条带大小成正比的，
同样背景下，大条带比较亮。
所以我的经验是500-1000bp

作者: 33号 时间: 2015-9-4 17:31

我做热启动都是先不加酶，在95度变性后设一个72度无限期的步骤。打开PCR仪盖，逐个加酶，然后开始循环。

作者: 8964357 时间: 2015-9-4 17:32

QUOTE:

原帖由 33号 于 2015-9-4 17:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我做热启动都是先不加酶，在95度变性后设一个72度无限期的步骤。打开PCR仪盖，逐个加酶，然后开始循环。

要做96孔板PCR还不累死了。

作者: www.1 时间: 2015-9-4 17:33

我的样品不多。
先加酶再升温不是严格的热启动，除非使用抗体说石蜡封闭的taq。
抗体或石蜡封闭的taq就是解决了高通量的问题。
我是做基因克隆，通量不大，但酶都是高保真的。

作者: vcve 时间: 2015-9-4 17:34

我的方法与之差不多。一般PCR都有一个5分钟的变性期，在变性将近结束时，使PCR仪pause，加入taq酶。然后go on。。。。

作者: 8964357 时间: 2015-9-4 17:35

我的样品不多。
先加酶再升温不是严格的热启动，除非使用抗体说石蜡封闭的taq。
抗体或石蜡封闭的taq就是解决了高通量的问题。
我是做基因克隆，通量不大，但酶都是高保真的。
......

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这也许是临床出身和基础出身的差别吧。
我们总是有结果就可以了，不够严格，
以后还须多多学习，呵呵……
各说各的理，相互多交流吧。
关键看疗效！！！

作者: langlang 时间: 2015-9-4 17:36

打开PCR仪，预热到80度.

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怎么操作？我是菜鸟，不明白该怎么样预热！

作者: nn255 时间: 2015-9-4 17:36

俺8个片段的RT－PCR都是用热启动做的，懒得一一去摸条件。
PCR反应体系配制好，不加酶，分装到各已加cDNA模板的PCR管中。
酶用Buffer、水稀释到0.5U/μL备用。
将PCR管置PCR仪上，设85度5min，在运行到第3分钟时，开盖，为每管加入稀释好的酶溶液，20μL体系加2μL酶溶液，终浓度为1U/体系。然后95度3min------开始PCR正常循环。
2分钟搞定开盖和加酶，对小于十个样本还行，多了就手忙脚乱。
看着PCR管冒气蒸发（用热盖，不加油），心里着急是肯定的。

作者: eor 时间: 2015-9-4 17:38

在传统的PCR反应中，极易发生引物错配和二聚体的形成，继而导致非特异性产物的扩增。热启动方法的问世有效地解决了这些问题，不仅优化了目标扩增产物，同时也减少了非特异性扩增，而且使得在传统PCR技术中较难扩增的单拷贝基因以及超长片段变得更简便。
金思德 E1000-PCR仪是目前市场上唯一具有热启动功能的PCR仪，它主要是通过物理方法实现的热启动，能够在不使用昂贵的热启动酶的条件下，就可以有效地减少反应中非特异性产物的产生。
经实验室的研究结果表明，通过使用E1000-PCR仪的热启动功能，能够有效地帮助实验人员在做较难扩增的目标产物时得到最佳的实验结果，减少实验摸索时间，快速解决问题。

作者: vcve 时间: 2015-9-4 17:38

一定要热启动吗？

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