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标题: 【求助】RNA 电泳出现4条带,不知道什么原因 [打印本页]

作者: langlang 时间: 2015-9-4 17:42 标题: 【求助】RNA 电泳出现4条带,不知道什么原因

今天提RNA，跑电泳后感觉28s，18s，5s都不错，28s和18s都挺亮的，但就是在28s上面还有一条清晰的条带，不知道什么原因，用rna酶处理后所有条带消失，证明应该不是DNA污染，请高手指点？

作者: xue258 时间: 2015-9-4 17:42

不知楼主是如何确定28s，18s和5s的，是否有加Marker对照？还有楼主提RNA的材料是动物的还是植物的？如果是动物的，那确实有些奇怪；如果是植物叶片，那出现4条带是正常的，因为除了28s，18s，5s外，植物叶片中还有叶绿体RNA。不过这叶绿体RNA是在18S后面5S前面。如果真的如楼主所说是在28S前面而又会被RNase所降解，那这种现象确实有值得讨论的价值。
建议把图片贴上来，这样更容易判断。

作者: qianqin1977 时间: 2015-9-4 17:43

绿色植物的RNA条带多了叶绿体RNA，有时还不止多一条。
是水稻叶片的RNA，除去28s，18s，5s，还有两条带！

作者: langlang 时间: 2015-9-4 17:43

我提的是动物的RNA，用的是QIagen的试剂盒，因为我看第二条带(可能是28s)比第三条带（可能18s）亮差不多1倍，第四条带（可能5s）可见但不是很清楚。第一条要比第四条清楚，比第二和三要弱些。

作者: xue258 时间: 2015-9-4 17:44

还是建议把图贴上来，这样更加的直观，交流更加方便。还有能把哪种动物哪部分组织都讲得详细些吗，相信园内会有这方面的高手。
判断28S、18S，一般情况下是可以不用RNA Marker的，但你的情况真的比较奇怪。建议可以用RNA Marker做个参照，比如人的28S、18S的rRNA分别是5.0kb和1.9kb，老鼠的28S、18S的rRNA分别是4.7kb和1.9kb。

作者: langlang 时间: 2015-9-4 17:45

谢谢各位战友！
我提的是大鼠的肠道组织，图片在附件中

图片附件: 44475222.jpg (2015-9-4 17:45, 48 KB) / 该附件被下载次数 42
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=36988

作者: txwuyan 时间: 2015-9-4 17:47

貌似28S部分降解形成，我以前也遇到过

作者: xue258 时间: 2015-9-4 17:49

从图来看，确实很奇怪。看起来像是基因组或者是蛋白污染，但楼主说用RNase处理全部条带消失，所以我也不能确定哪一条是28S。
最直接的方法就是拿RNA Marker对照大小来判断。或者是把胶中的最上面的那一条带割胶，加入少量融胶液或者在低于55度下融胶，再加入少量RNase，然后电泳。如果电泳结果没看到任何条带，那应该就是RNA了。如果是RNA，那真的是很奇怪的现象，因为以前从来没有听说动物的组织RNA电泳有四条带的。如果电泳能看到条带，那应该是基因组污染或蛋白污染。
我知道的就只有这些了，祝实验顺利

作者: vvmmoy 时间: 2015-9-4 17:50

几种可能:
1.可注意RNA的降解：RNA部分降解的可能性很大，要求塑料耗材需要用DEPC浸泡过夜后高压灭菌。如果使用的是一次性的塑料耗材，可以直接高压灭菌用于实验。使用的蒸馏水需要配成0.1%DEPC水过夜后高压灭菌。操作过程，尽量不要交谈，可以不带口罩。
2.注意DNA或蛋白质的污染：细胞裂解后离心，取样时需要小心，只能取上清夜，如果取到中间层则可能引起DNA的污染。
RNA完整性的鉴定：一般我们使用的是琼脂糖凝胶电泳。由于我们使用的是公共设备，电泳槽及缓冲液中含有RNAase，所以需要用洗衣粉彻底清洗，并换新配置的TAE/TBE。否则会将电泳过程造成的讲解误认为是提取RNA过程中的降解。

作者: dog002 时间: 2015-9-4 17:50

不对，那不是蛋白或DNA污染。
那一条带叫大分子RNA，常见于鼠组织。用RNA酶处理后会消失。

作者: xue258 时间: 2015-9-4 17:51

请教一下楼上的，什么是大分子RNA？它是属于哪一类的RNA？谢谢！

作者: shkudo 时间: 2015-9-4 17:53

楼主能不能将所提取的RNA取一点65度保温5分钟，再与没保温的对比电泳一次，并且加上marker，用DNAmarker也可，注明胶浓度。

作者: kulee 时间: 2015-9-4 17:53

可能是RNA降解所致，我以前提取过水稻根系中的RNA，也出现过这种现象，后来换用新鲜样品后这种情况就消失了。我觉得样品降解的可能性最大，你可以找一些新鲜组织再做一下，祝顺利！

作者: langlang 时间: 2015-9-4 17:54

请教：65度5min，目的是什么呢？

作者: woshi 时间: 2015-9-4 17:54

我们做的大MICE的RNA也是这样,但RT做没有问题,也就没有深究,也很想知道为什么?

作者: daod 时间: 2015-9-4 17:54

大鼠是不是有什么病，有可能是病毒的基因组
也会不会是大的核酶一类的东西
如果很常见的话，那就不知道什么了

作者: yonger 时间: 2015-9-4 17:56

有些战友认为这是RNA降解所致，请问能否判断是什么 RNA降解的产物呢？
也许是基因组污染，但是你用的RNase质量不好，其中含有DNase，所以一处理结果就消失了
我也想问一下楼上建议的65度5min，目的是什么呢？

作者: eric930 时间: 2015-9-4 17:56

觉得是RNA降解所至，建议从新实验一次

作者: DCS 时间: 2015-9-4 17:57

相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征
回答楼主和94520425，
照片上有6条带，4，5，6三条我认为是28s，18s，5s，而2，3通常也会出现，应为很弱（如a3）不被重视，分歧就在1带，RNase处理后1也消失，因此否定了我认为最大可能的基因组DNA，那么就可能是蛋白，但我想楼主操作时不会带入这么多蛋白吧（这点我不能肯定，因为b3、b4、b5亮度均高于a3、a4、a5，而b1却弱于a1），如果排除蛋白，那a1就可能是RNA的二级结构，不同构象电泳速率也是不同的。
65度保温5分钟后冰上急冷，RNA二级结构打开再电泳，就应该是三条带了。
愚之拙见，仅供参考。

图片附件: 35899944.jpg (2015-9-4 17:57, 51.4 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=36989

作者: veiwu 时间: 2015-9-4 17:58

DNA污染是不是？？

作者: xevin 时间: 2015-9-4 17:58

建议楼主到下面的网址请教核酸抽提专家：Big Smile
核酸抽提：质量检测电泳照片的判读经验谈 (最好附照片) - 丁香园论坛
相信会得到更满意的答复

作者: ha111 时间: 2015-9-4 17:59

典型的没有处理好DNA，Trizol加少了。

作者: am10 时间: 2015-9-4 17:59

应该是降解了

作者: veiwu 时间: 2015-9-4 18:00

相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征
回答楼主和94520425，
照片上有6条带，4，5，6三条我认为是28s，18s，5s，而2，3通常也会出现，应为很弱（如a3）不被重视，分歧就在1带，RNase处理后1也消失，因此否定了我认为最大可能的基因组DNA，那么就可能是蛋白，但我想楼主操作时不会带入这么多蛋白吧（这点我不能肯定，因为b3、b4、b5亮度均高于a3、a4、a5，而b1却弱于a1），如果排除蛋白，那a1就可能是RNA的二级结构，不同构象电泳速率也是不同的。
65度保温5分钟后冰上急冷，RNA二级结构打开再电泳，就应该是三条带了。
同意chuyi2008的观点!全面,有道理!

作者: xuuuu 时间: 2015-9-4 18:01

希望楼主能在各位战友的帮助下找到真正的原因，更希望楼主把这个原因告诉大家，期待中……

作者: xuuuu 时间: 2015-9-4 18:03

谢谢各位战友！
我提的是大鼠的肠道组织，图片在附件中

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个人经验:
各位分析很有道理,但本人感觉对DNAase的处理不敢认同,我们经验发现有些商家的DNAase质量不好,包括RNAase配置不当后处理条带全无.所以个人认为可以设置control比一切猜测更好.对于DNA污染的control可以用同中基因组DNA点样外加MARKER,28S RNA的位置就很容易确定了.若有质量不错的总RNA样品更好了(实际许多kit中带有controlRNA,拿来用).另外,你的电泳时间不知长否?最好快速电泳.仅供参考!!

作者: seagate 时间: 2015-9-4 18:03

28S上面的条带是hnRNA,即RNA前体，在植物组织的RNA中比较常见。提得好一般能看到。
不是DNA，DNA一般在泳道，出不来。

作者: langlang 时间: 2015-9-4 18:04

谢谢各位战友！
后面用trizol提rna没有出现此种情况，但是用QIGENE试剂盒提取还是同样的出现了四条带。怀疑是否是试剂盒的原因

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