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标题: 【求助】qPCR如何确保复孔一致性 [打印本页]

作者: mimili_901 时间: 2015-9-4 18:06 标题: 【求助】qPCR如何确保复孔一致性

目前正做qpcr,引物特异性没有问题，目前就是副孔，重复ct值相差太大，相求助战友们
就我而言，我现在做的是20ul体系
现配总的混合液，之后每个样品都配混合液，再涡旋5秒钟，枪头吹打5下，之后上样
但是结果还是不能确保，ct值相差非常大
所以，我想知道大家都是怎么混合的？有什么经验方法可以指教下
ps:加样时候是不是必须加到管底？
总结就是：如何混合？如何加样？
不甚感激。。。。

作者: vcve 时间: 2015-9-4 18:06

我们加样没有加到管底，最后用离心机离的。
同一种引物的按量算好和mix一起配的混合液，然后每孔加，最后单独加的cDNA模板。

作者: mimili_901 时间: 2015-9-4 18:07

QUOTE:

原帖由 vcve 于 2015-9-4 18:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我们加样没有加到管底，最后用离心机离的。
同一种引物的按量算好和mix一起配的混合液，然后每孔加，最后单独加的cDNA模板。

谢谢你的回答！
我很想知道你们没加到管底，离心多久，多大转数？我个人感觉还是会有少数几个孔会有气泡，并且还是在离心后

作者: queen 时间: 2015-9-4 18:07

我建议，配总管的时候，是加水，mix和cDNA模板。混匀，每孔加好，最后再加引物的，因为20ul体系中经常只需要1ul的模板，如果是最后每个孔每个孔的加，枪头外带一点点，误差就会大。至于要不要加到管底是无所谓的，一离心就会到管底的。还有气泡的问题，我们知道，PCR开始的时候，温度是升高到95度的，这样的高温，气泡都会破的。

作者: vcve 时间: 2015-9-4 18:08

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谢谢你的回答！
我很想知道你们没加到管底，离心多久，多大转数？我个人感觉还是会有少数几个孔会有气泡，并且还是在离心后

就离一会，转速不知道是多少呢？我都没有离固定时间的。呵呵

作者: mimili_901 时间: 2015-9-4 18:08

QUOTE:

原帖由 queen 于 2015-9-4 18:07 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我建议，配总管的时候，是加水，mix和cDNA模板。混匀，每孔加好，最后再加引物的，因为20ul体系中经常只需要1ul的模板，如果是最后每个孔每个孔的加，枪头外带一点点，误差就会大。至于要不要加到管底是无所谓的，一离心就会到管底的。还 ...

可是我加入的DNA模版不同，如何配总管啊？相反我的引物是同样的，可是照你的意思，我加入1-2ul 模版应该就会误差很大，如何解决这个问题啊？
PS：顺便问下阴性对照有结果，怎么办？谢谢啦

作者: abc816 时间: 2015-9-4 18:08

我一般先加模板，然后加引物，最后加mix，每个孔pipette10来次，然后简单转一下，去掉气泡（这步也不是很必要），平行的空，大部分小数点后一位到两位的误差是正常的

作者: zhy平平 时间: 2015-9-4 18:09

我是一个样品配一个总管。阴性对照有结果是不是你有污染或者操作不当？我之前有一次做的时候发现阴性对照的CT值也在30之前，后来发现是仪器的问题，换了台仪器就好了。

作者: mimili_901 时间: 2015-9-4 18:09

我建议，配总管的时候，是加水，mix和cDNA模板。混匀，每孔加好，最后再加引物的，因为20ul体系中经常只需要1ul的模板，如果是最后每个孔每个孔的加，枪头外带一点点，误差就会大。至于要不要加到管底是无所谓的，一离心就会到管底的。还有气泡的问题，我们知道，PCR开始的时候，温度是升高到95度的，这样的高温，气泡都会破的。

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引物加的更少吧，也就0.4ul，比模板要少，按您的说法“最后每个孔每个孔的加，枪头外带一点点，误差就会大”，就算最后加引物是不是也同样存在误差大的问题呢？如果担心枪头外带一点点误差大的话，可以换枪头吧，不过有点浪费。

作者: one 时间: 2015-9-4 18:10

对每一台q-pcr仪做不同的实验，需要试条件，重复多次，达到稳定后才正式实验。这样就好了。

作者: 2541 时间: 2015-9-4 18:10

考虑下是否仪器的问题，之前遇到过，换新仪器就解决了

作者: am10 时间: 2015-9-4 18:10

操作的确的确很关键。还有一个技巧是，提高cDNA的体积。我们做384孔 qPCR总体系10ul，除了mastermix和引物、探针之外（大概7ul），其余全部都加上稀释好的模板。如果你只加1ul的模板，肯定不准确，复孔差异都很大。

作者: ero11 时间: 2015-9-4 18:11

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操作的确的确很关键。还有一个技巧是，提高cDNA的体积。我们做384孔 qPCR总体系10ul，除了mastermix和引物、探针之外（大概7ul），其余全部都加上稀释好的模板。如果你只加1ul的模板，肯定不准确，复孔差异都很大。 ...

384well？不会眼花？

作者: ffaa 时间: 2015-9-4 18:11

We use EPMOTION 5075 for automatically pipetting .

图片附件: 20702233.jpg (2015-9-4 18:11, 21.7 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=36990

作者: summerxx 时间: 2015-9-4 18:12

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We use EPMOTION 5075 for automatically pipetting .

这个绝对是高科技了，我们同样是用384well plate，同样是10ul的体系，可惜只能每次用手加了。
刚开始做的时候数据确实丑的想撞墙，不过多做几轮后就好多了，我每次3个复孔之间的SD能够控制在0.00x-0.0x之间。

作者: ffaa 时间: 2015-9-4 18:12

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原帖由 summerxx 于 2015-9-4 18:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

这个绝对是高科技了，我们同样是用384well plate，同样是10ul的体系，可惜只能每次用手加了。
刚开始做的时候数据确实丑的想撞墙，不过多做几轮后就好多了，我每次3个复孔之间的SD能够控制在0.00x-0.0x之间。 ...

怎么叫“丑的想撞墙“？
建议向楼主谈谈你是怎样有效控制复孔的SD的。

作者: cbou876 时间: 2015-9-4 18:13

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We use EPMOTION 5075 for automatically pipetting .

只能说你们太有钱了。我们96well的都是一个一个加，跟老板说买把排枪，老板说我们不常用，其实天天在做realtime，晕死了。数据有跳动就给脸色看。。。

作者: veiwu 时间: 2015-9-4 18:13

排枪没用的，pcr体系都很小，排枪取液时液面不够深，也很难做到均一。

作者: shkudo 时间: 2015-9-4 18:13

溶解曲线是这种怎么解释？扩增曲线是S型

作者: ha111 时间: 2015-9-4 18:14

这个绝对是高科技了，我们同样是用384well plate，同样是10ul的体系，可惜只能每次用手加了。
刚开始做的时候数据确实丑的想撞墙，不过多做几轮后就好多了，我每次3个复孔之间的SD能够控制在0.00x-0.0x之间。

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这个SD控制不要太好啊！请教怎么做到的，期待大神回复

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