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标题: 求助PCR引物情况 [打印本页]

作者: #甜# 时间: 2011-9-15 12:27 标题: 求助PCR引物情况

求助PCR引物情况 [转载]

朋友设计了两对引物做RT-PCR，PCR条件摸索了好长时间，退火温度也基本都试过了，仍然没有结果，目前怀疑引物设计可能有问题，请那位高手出马帮忙给分析一下，下面是其中的一对引物：
R1：antisense:5－CAT TCC GCT TTT GTT CAT TTG G－3
   sense: 5－GAA GCT CCT GGA TTT CCT CAT CA－3
mRNA序列： 1 ctctgacctg agaccaatag ctgtgtctac ccggactcag cgtccagctc accgccacta
   61 acgcgccgcg cattggacac ctgatccaca caccttcggg caccagtgaa aaaccgcgac
   121 ttgattttct ggaagaacgc ccccagggtg tgggagcggt cgtggaggac cagcaggagg
   181 aagcggaggg gagaggggca gtagtggagg cagagaaagc gttgaaccag ctgtgttggc
   241 cgaaggcacg aaacggcaaa aggcagcggt gagcatctgt gtggttcccg ctgggaacct
   301 gcaggcagga ccggcgtggg aacgtggctg gcccgcggtg gaccgcgtct tcgccacaat
   361 ggtccggctc ctcttgattt tcttcccaat gatctttttg gagatgtcca ttttgcccag
   421 gatgcctgac agaaaagtat tgctggcagg tgcctcgtcc cagcgctccg tggcgagaat
   481 ggacggagat gtcatcatcg gagccctctt ctcagtccat caccagcctc cagccgagaa
   541 ggtacccgaa aggaagtgtg gggagatcag ggaacagtat ggtatccaga gggtggaggc
   601 catgttccac acgttggata agattaacgc ggacccggtg ctcctgccca acatcactct
   661 gggcagtgag atccgggact cctgctggca ctcttcagtg gctctcgaac agagcatcga
   721 attcatcaga gactccctga tttccatccg agatgagaag gatgggctga accgatgcct
   781 gcctgatggc cagaccctgc cccctggcag gactaagaag cctattgctg gagtgatcgg
   841 ccctggctcc agctctgtgg ccattcaagt ccagaatctt ctccagctgt tcgacatccc
   901 acagatcgcc tattctgcca caagcataga cctgagtgac aaaactttgt acaaatactt
   961 cctgagggtg gtcccttctg acactttgca ggcaagggcg atgctcgaca tagtcaagcg
   1021 ttacaactgg acctatgtct cagcagtcca cacagaaggg aattacggcg agagtggaat
   1081 ggatgctttc aaagaactgg ctgcccagga aggcctctgc atcgcacact cggacaaaat
   1141 ctacagcaat gctggcgaga agagctttga ccggctcctg cgtaaactcc gggagcggct
   1201 tcccaaggcc agggttgtgg tctgcttctg cgagggcatg acagtgcggg gcttactgag
   1261 tgccatgcgc cgcctgggcg tcgtgggcga gttctcactc attggaagtg atggatgggc
   1321 agacagagat gaagtcatcg aaggctatga ggtggaagcc aacggaggga tcacaataaa
   1381 gcttcagtct ccagaggtca ggtcatttga tgactacttc ctgaagctga ggctggacac

作者: #甜# 时间: 2011-9-15 12:28

1441 caacacaagg aatccttggt tccctgagtt ctggcaacat cgcttccagt gtcgcctacc
   1501 tggacacctc ttggaaaacc ccaactttaa gaaagtgtgc acaggaaatg aaagcttgga
   1561 agaaaactat gtccaggaca gcaaaatggg atttgtcatc aatgccatct atgccatggc
   1621 acatgggctg cagaacatgc accatgctct gtgtcccggc catgtgggcc tgtgtgatgc
   1681 tatgaaaccc attgatggca ggaagctcct ggatttcctc atcaaatcct cttttgtcgg
   1741 agtgtctgga gaggaggtgt ggttcgatga gaagggggat gctcccggaa ggtatgacat
   1801 tatgaatctg cagtacacag aagctaatcg ctatgactat gtccacgtgg ggacctggca
   1861 tgaaggagtg ctgaatattg atgattacaa aatccaaatg aacaaaagcg gaatggtacg
   1921 atctgtgtgc agtgagcctt gcttaaaggg tcagattaag gtcatacgga aaggagaagt
   1981 gagctgctgc tggatctgca cggcctgcaa agagaatgag tttgtgcagg acgagttcac
   2041 ctgcagagcc tgtgacctgg ggtggtggcc caacgcagag ctcacaggct gtgagcccat
   2101 tcctgtccgt tatcttgagt ggagtgacat agaatctatc atagccatcg ccttttcttg
   2161 cctgggcatc ctcgtgacgc tgtttgtcac cctcatcttc gttctgtacc gggacacacc
   2221 cgtggtcaaa tcctccagta gggagctctg ctatatcatt ctggctggta ttttcctcgg
   2281 ctatgtgtgc cctttcaccc tcatcgccaa acctactacc acatcctgct acctccagcg
   2341 cctcctagtt ggcctctctt ctgccatgtg ctactctgct ttagtgacca aaaccaatcg
   2401 tattgcacgc atcctggctg gcagcaagaa gaagatctgc acccggaagc ccagattcat
   2461 gagcgcttgg gcccaagtga tcatagcctc cattctgatt agtgtacagc taacactagt
   2521 ggtgaccttg atcatcatgg agcctcccat gcccattttg tcctacccga gtatcaagga
   2581 agtctacctt atctgcaata ccagcaacct gggtgtagtg gcccctgtgg gttacaatgg
   2641 actcctcatc atgagctgta cctactatgc cttcaagacc cgcaacgtgc cggccaactt
   2701 caatgaggct aaatacatcg ccttcaccat gtacactacc tgcatcatct ggctggcttt
   2761 cgttcccatt tactttggga gcaactacaa gatcatcact acctgcttcg cggtgagcct
   2821 cagtgtgacg gtggccctgg ggtgcatgtt tactccgaag atgtacatca tcattgccaa
   2881 acctgagagg aacgtccgca gtgccttcac gacctctgat gttgtccgca tgcacgtcgg
   2941 tgatggcaaa ctgccgtgcc gctccaacac cttcctcaac attttccgga gaaagaagcc
   3001 cggggcaggg aatgccaatt ctaacggcaa gtctgtgtca tggtctgaac caggtggaag

作者: #甜# 时间: 2011-9-15 12:28

3061 acaggcgccc aagggacagc acgtgtggca gcgcctctct gtgcacgtga agaccaacga
   3121 gacggcctgt aaccaaacag ccgtaatcaa acccctcact aaaagttacc aaggctctgg
   3181 caagagcctg accttttcag atgccagcac caagaccctt tacaatgtgg aagaagagga
   3241 caatacccct tctgctcact tcagccctcc cagcagccct tctatggtgg tgcaccgacg
   3301 cgggccaccc gtggccacca caccacctct gccaccccat ctgaccgcag aagagacccc
   3361 cctgttcctg gctgattccg tcatccccaa gggcttgcct cctcctctcc cgcagcagca
   3421 gccacagcag ccgccccctc agcagccccc gcagcagccc aagtccctga tggaccagct
   3481 gcaaggcgta gtcaccaact tcggttcggg gattccagat ttccatgcgg tgctggcagg
   3541 cccggggaca ccaggaaaca gcctgcgctc tctgtacccg cccccgcctc cgccgcaaca
   3601 cctgcagatg ctgcccctgc acctgagcac cttccaggag gagtccatct cccctcctgg
   3661 ggaggacatc gatgatgaca gtgagagatt caagctcctg caggagttcg tgtacgagcg
   3721 cgaagggaac accgaagaag atgaattgga agaggaggag gacctgccca cagccagcaa
   3781 gctgacccct gaggattctc ctgccctgac gcctccttct cctttccgag attccgtggc
   3841 ctctggcagc tcagtgccca gttcccccgt atctgagtcg gtcctctgca cccctccaaa
   3901 tgtgacctac gcctctgtca ttctgaggga ctacaagcaa agctcttcca ccctgtagtg
   3961 tgtgtgtgtg tgtggggggg ggggggagtg cgcatggaga agccagagat gccaaggagt
   4021 gtcaaccctt ccagaaatgt gtagaaagca gggtgaggga tggggatgga ggaccacggt
   4081 ctgcagggaa gaaaaaaaaa atgctgcggc tgccttaaag aaggagaggg acgatgccaa
   4141 ctgaacagtg gtcctggcca ggattgtgac tcttgaatta ttcaaaaacc ttctctagaa
   4201 agaaagggaa ttatgacaaa gcacaattcc atatggtatg taacttttat cgaaaaaaat
   4261 aataaaacgt aaaaataaaa tc

作者: 韩梅梅 时间: 2011-9-15 12:29

分析结果如下：我觉得设计挺好，虽有不足，但不应该影响大局，你的内参扩的如何？？
１。一般情况：
--------------------------------------------------------------------------------
Selected Primers
--------------------------------------------------------------------------------
New:1702U23 Upper Primer
5' GAA GCT CCT GGA TTT CCT CAT CA 3'
Length: 23-mer
5' 1702
Tm: 69.6 °C (salt 1000.0 mM; oligo 100.0 pM)
deltaG (25 °C): -42.8 kcal/mol
Degeneracy: 1
P.E.#: 417/418
1/E: 4.69 nmol/A260
33.1 µg/A260
New:1894L22 Lower Primer
5' CAT TCC GCT TTT GTT CAT TTG G 3'
Length: 22-mer
3' 1894
Tm: 69.6 °C (salt 1000.0 mM; oligo 100.0 pM)
deltaG (25 °C): -42.9 kcal/mol
Degeneracy: 1
P.E.#: 473/473
1/E: 5.20 nmol/A260
35.1 µg/A260

２。3'二聚体
uper : - 1.9 lower: -3.1 uper/loer: 1.9

3. 3'发夹结构：
uper: X lower: X

4: PCR:

Optimal Annealing Temperature: 55.4° (Max: 72.0°)
--------------------------------------------------------------------
Position Length Tm [°C] GC [%] P.E.#
--------------------------------------------------------------------

作者: 韩梅梅 时间: 2011-9-15 12:29

Product ----- 214 84.0 46.3 46.3
Upper Primer 1702 23 72.3 47.8 417/418
Lower Primer 1894 22 72.0 40.9 473/473
--------------------------------------------------------------------
Product Tm - Lower Primer Tm: 12.0
Primers Tm difference: 0.3
----------------------------------
Concentration
----------------------------------
Upper Primer 200.0 nM
Lower Primer 200.0 nM
Monovalent Cation 50.0 mM
Free Mg[2+] 0.7 mM
----------------------------------
Total Na[+] Equivalent: 155.8

5.内部稳定性

图片附件: 112176-luke-embed.jpg (2011-9-15 12:30, 21.74 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8575

作者: #甜# 时间: 2011-9-15 12:30

非常非常感谢你的帮助，看的出来你是个行家。我的内参扩的挺好，用的倍他actin，退火温度58度。按照你的分析，我按照这对引物能扩出来？退火温度在55度附近还是在70度附近？还请继续指点。

作者: 韩梅梅 时间: 2011-9-15 12:31

55C退货，所有时间都确定在20sec左右

作者: #甜# 时间: 2011-9-15 12:31

再请教您一个问题：是所有时间（循环中的变性时间、退火时间、延伸时间）均为20″吗？我按这个方案做了，结果目的条带不够亮，杂带（约400余bp）比marker还亮。

作者: 韩梅梅 时间: 2011-9-15 12:32

提高退火温度，。热启动。

请详细说明你的体系情况和使用的酶的情况。和PCR电泳图。

作者: #甜# 时间: 2011-9-15 12:32

敬请指点：我设置了五个温度，53\56\57\59\61度，55\57均有三条带，两条又细又亮的是杂带，目的基因片断模糊。我的体系25ul,为：
H2O 16ul
10*Buffer 2.5ul
Mgcl2 1.5ul
P1 1ul
P2 1ul
dNTP 0.5ul
Taq 0.5ul
cDNA 2ul
石腊油 20ul
两步法，pcr循环为：95,4min;95,35sec 退火温度35sec 72,15或25或35sec均试过，35循环；72,7分钟；4,保存
怎么办？

作者: #甜# 时间: 2011-9-15 12:32

另外酶是MBI的，5u/ul

作者: 韩梅梅 时间: 2011-9-15 12:33

毛病不会在引物的特异性吧？这个我可没办法估计，你再查查。

还有，是不是误差太大？

昨天有一个师兄做25ul体系无果，做50ul体系就做出来了。

想来毛病应该在误差上。

MBI ? 我没用过，立陶宛的公司？是不是还不如上海Promega了？我不知道，不过内参扩出来就应该问题不大。

作者: 冰激凌小姐 时间: 2011-9-15 12:34

我是#甜#所说的朋友，非常感谢你的指点。因我后续实验要做荧光PCR，因此杂带的出现非常不利。我今下午把延伸时间减为0sec，即温度两点法，去除了其中一条杂带，目的基因明显变亮，但另一条杂带仍无法去除，目前我决定换引物。另一对引物也想请您指点：引物序列为：
sense:5'caa ccc tgg tta tcg tct cat tg3'
antisense:5'agg cta acg gag atg cac att g3'

作者: 韩梅梅 时间: 2011-9-15 12:34

下游引物和目的基因没有同源性
cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html')

作者: 冰激凌小姐 时间: 2011-9-15 12:34

非常抱歉，刚刚引物反义链输入错误。正确为：
sense:5'caa ccc tgg tta tcg tct cat tg3'
antisense:5'cgt tcc ctt ctg tgt ctt ctt cc3'。另基因库序列文档太大，若您愿意帮忙的话，可在网上下载。号码为：NW_043767. Rattus norvegicus
912621 bp DNA
非常非常感谢您的指点，还想麻烦您继续指导。

作者: 韩梅梅 时间: 2011-9-15 12:35

分析结果如下：我觉得设计挺好，虽有不足这回是引物二聚体倾向稍大，但不应该影响大局。通过提高退火温度应该能解决。
１。一般情况：
--------------------------------------------------------------------------------
Selected Primers
--------------------------------------------------------------------------------
NewSequence1:1596U23 Upper Primer
5' CAA CCC TGG TTA TCG TCT CAT TG 3'
Length: 23-mer
5' 1596
Tm: 68.5 °C (salt 1000.0 mM; oligo 100.0 pM)
deltaG (25 °C): -42.1 kcal/mol
Degeneracy: 1
P.E.#: 413/413
1/E: 4.78 nmol/A260
33.7 µg/A260
NewSequence1:1727L23 Lower Primer
5' CGT TCC CTT CTG TGT CTT CTT CC 3'
Length: 23-mer
3' 1727
Tm: 69.3 °C (salt 1000.0 mM; oligo 100.0 pM)
deltaG (25 °C): -42.6 kcal/mol
Degeneracy: 1
P.E.#: 421/421
1/E: 5.35 nmol/A260
37.2 µg/A260

２。3'二聚体
uper : - 3.8 lower: X uper/loer: X

3. 3'发夹结构：
uper: X lower: X

4: PCR:

作者: 韩梅梅 时间: 2011-9-15 12:36

--------------------------------------------------------------------------------
PCR
--------------------------------------------------------------------------------
Optimal Annealing Temperature: 55.9° (Max: 72.0°)
--------------------------------------------------------------------
Position Length Tm [°C] GC [%] P.E.#
--------------------------------------------------------------------
Product ----- 154 85.1 51.3 51.3
Upper Primer 1596 23 71.2 47.8 413/413
Lower Primer 1727 23 71.9 52.2 421/421
--------------------------------------------------------------------
Product Tm - Upper Primer Tm: 14.0
Primers Tm difference: 0.7
----------------------------------
Concentration
----------------------------------
Upper Primer 200.0 nM
Lower Primer 200.0 nM
Monovalent Cation 50.0 mM
Free Mg[2+] 0.7 mM
----------------------------------
Total Na[+] Equivalent: 155.8
5.内部稳定性

图片附件: 114180-soina-embed.jpg (2011-9-15 12:36, 52.46 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8576

作者: 韩梅梅 时间: 2011-9-15 12:36

如果引物还没有定，建议
上游引物向5'端前进两个碱基，改为：
ACCAACCCTGGTTATCGTCTCAT
下游引物向3'端前进一个碱基，改为：
GCGTTCCCTTCTGTGTCTTCTTC

此时上游引物二聚体倾向则为－1.5，比-3.8好很多了
其余参数没有大的变动。

PCR产物改为157bp ,退火56C
如果用PE9600或以上的机器,以及薄壁小管，
延伸温度改为0sec没有问题。

此时的内部稳定性就好多了你看是不是：

图片附件: 114186-soina-embed.jpg (2011-9-15 12:36, 49.2 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8577

作者: 冰激凌小姐 时间: 2011-9-15 12:37

非常非常您的指点,我试试.您对这些东西顺手拈来这么熟悉,功夫真不浅哪.

作者: 韩梅梅 时间: 2011-9-15 12:37

呵呵，不要客气，
通过我们的努力能使更多的人学会一些东东是最好的了。。

这几天我在这里光围着引物转呢，
也做了很多范例，

相信有心人能学到不少东西，
也希望被帮的人能及时反馈，

那怕我的建议no work，
我也需要反馈，这样才能改进。

呵呵～～～～～～～～～～～～～

祝你好运～～～～～～～～～～～～～～～

作者: 冰激凌小姐 时间: 2011-9-15 12:38

韩梅梅大侠：
我请生工重新设计了引物，他们重新设计的第一、第二对引物序列如下：
第一对：Fwd:ATTCTGCCACAAGCATAGACC gc=47.6% Tm=59.2C rev:CCACTCTCGCCGTAATTCC gc=57.9% Tm=60.6C
(length=166bp,912-1077)

第二对：U06832:
Fwd:AAGGAAGCTATGGAGAGAAAGG gc=45.5% Tm=58.2C rev:TTGGCAAAAATCACGACG gc=44.4% Tm=59.2C
(length=184bp,812-995)，您觉得怎样？

作者: 韩梅梅 时间: 2011-9-15 12:38

都是同行，我不作评价各说各的理吧。

第二对引物分析如下：
１。一般情况：
Sequence: sonia.seq Page 1 Feb 08, 2003 (05:43 PM)
--------------------------------------------------------------------------------
Selected Primers
--------------------------------------------------------------------------------
New:812U22 Upper Primer
5' AAG GAA GCT ATG GAG AGA AAG G 3'
Length: 22-mer
5' 812
Tm: 64.2 °C (salt 1000.0 mM; oligo 100.0 pM)
deltaG (25 °C): -40.4 kcal/mol
Degeneracy: 1
P.E.#: 399/399
1/E: 4.12 nmol/A260
28.9 µg/A260
New:978L18 Lower Primer
5' TTG GCA AAA ATC ACG ACG 3'
Length: 18-mer
3' 978
Tm: 62.8 °C (salt 1000.0 mM; oligo 100.0 pM)
deltaG (25 °C): -35.9 kcal/mol
Degeneracy: 1
P.E.#: 409/409
1/E: 5.55 nmol/A260
31.0 µg/A260

２。PCR
--------------------------------------------------------------------------------

作者: 韩梅梅 时间: 2011-9-15 12:38

PCR
--------------------------------------------------------------------------------
Optimal Annealing Temperature: 54.6° (Max: 69.5°)
--------------------------------------------------------------------
Position Length Tm [°C] GC [%] P.E.#
--------------------------------------------------------------------
Product ----- 184 85.1 50.0 50.0
Upper Primer 812 22 66.5 45.5 399/399
Lower Primer 978 18 67.7 44.4 409/409
--------------------------------------------------------------------
Product Tm - Upper Primer Tm: 18.6
Primers Tm difference: 1.2
----------------------------------
Concentration
----------------------------------
Upper Primer 200.0 nM
Lower Primer 200.0 nM
Monovalent Cation 50.0 mM
Free Mg[2+] 0.7 mM
----------------------------------
Total Na[+] Equivalent: 155.8
Comments:
Terminal stability of the Lower Primer is too high.

作者: 韩梅梅 时间: 2011-9-15 12:39

3. 特殊结构：

二聚体：uper: X lower :-3.6 uper/lower: x

发夹结构：Ｘ lower X

４。内部稳定性：
从该例来看，可能会因此把PCR的可适退火温度局限在很窄的范围。应该PCR该成功问题不大.但条件苛刻。

图片附件: 114697-sonia-embed.jpg (2011-9-15 12:39, 44.02 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8578

作者: 韩梅梅 时间: 2011-9-15 12:40

第一对：
１。一般情况：
Selected Primers
--------------------------------------------------------------------------------
New:912U21 Upper Primer
5' ATT CTG CCA CAA GCA TAG ACC 3'
Length: 21-mer
5' 912
Tm: 64.1 °C (salt 1000.0 mM; oligo 100.0 pM)
deltaG (25 °C): -38.4 kcal/mol
Degeneracy: 1
P.E.#: 406/407
1/E: 4.92 nmol/A260
31.7 µg/A260
New:1059L19 Lower Primer
5' CCA CTC TCG CCG TAA TTC C 3'
Length: 19-mer
3' 1059
Tm: 65.1 °C (salt 1000.0 mM; oligo 100.0 pM)
deltaG (25 °C): -38.4 kcal/mol
Degeneracy: 1
P.E.#: 498/498
1/E: 6.07 nmol/A260
34.8 µg/A260

作者: 韩梅梅 时间: 2011-9-15 12:40

２。PCR
--------------------------------------------------------------------------------
PCR
--------------------------------------------------------------------------------
Optimal Annealing Temperature: 54.5° (Max: 70.6°)
--------------------------------------------------------------------
Position Length Tm [°C] GC [%] P.E.#
--------------------------------------------------------------------
Product ----- 166 84.6 49.4 49.4
Upper Primer 912 21 67.6 47.6 406/407
Lower Primer 1059 19 69.1 57.9 498/498
--------------------------------------------------------------------
Product Tm - Upper Primer Tm: 17.0
Primers Tm difference: 1.4
----------------------------------
Concentration
----------------------------------
Upper Primer 200.0 nM
Lower Primer 200.0 nM
Monovalent Cation 50.0 mM
Free Mg[2+] 0.7 mM
----------------------------------
Total Na[+] Equivalent: 155.8

作者: 韩梅梅 时间: 2011-9-15 12:40

3.特殊结构：
均为Ｘ］

４。内部稳定性：

图片附件: 114709-sonia-embed.jpg (2011-9-15 12:41, 50.14 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8579

作者: 韩梅梅 时间: 2011-9-15 12:41

从这两对引物设计而言，理论上设计还是过关的，

不过引物设计理念有点旧，

还是强调引发效率，那是另一种一种观念，

这是学术之间的差异，

不会有太多不得了的事。

问题不大。

祝你好运。

作者: 冰激凌小姐 时间: 2011-9-15 12:42

网上谋面，获得您频频帮助真是太荣幸了！我想根据您的建议请生工合成第二对引物，至于第一对引物，您看直接根据生工的设计合成引物以后会很好扩吗？虽然我很想请您帮忙设计第一对引物，但您已经帮了我很多忙，我也不好意思提出来。而且网上帮助别人，又没报酬，全凭一颗热心肠哪。

[ 本帖最后由冰激凌小姐于 2011-9-15 12:43 编辑 ]

作者: 韩梅梅 时间: 2011-9-15 12:42

你太客气了，
第一对引物生工设计的没问题。

其实他两队设计的都还可以，
就像学术的其他领域一样，观点不同是常见的事，
但这一般是非原则性问题。

、呵呵！！！……
祝你好运！！

作者: 冰激凌小姐 时间: 2011-9-15 12:43

换引物是pcr操作中的最下策了。如果换了一次引物还是做不出很满意的pcr结果，真是非常心烦的。这种感受兄弟可以理解吧？

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