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标题: 请教：实时荧光定量 [打印本页]

作者: 菠萝喵 时间: 2011-9-15 15:04 标题: 请教：实时荧光定量

请教：实时荧光定量 [转载]

请问：现在有实时荧光定量VEGF的试剂盒吗？有VEGF标准品卖吗？价钱？
         TaqMan探针大概价格是多少？
         如果没有标准品用实时荧光该如何定量？
         测定时须内参吗？
         谢谢指教

作者: 阿福 时间: 2011-9-15 15:05

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
　　荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。原理简述如下：
　　 1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

TaqMan 荧光探针工作原理
2）SYBR荧光染料：
　　在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
二．内标在传统定量中的意义
1．几种传统定量PCR方法简介：
　　1）内参照法：
　　在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。
　　2）竞争法：
　　选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数〔5〕。
　　3）PCR－ELISA法：
　　利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的〔6〕。
2．内标在传统定量中的作用
　　由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异（见图4），因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。

作者: 阿福 时间: 2011-9-15 15:06

三．内标对荧光定量PCR的影响
1．实时荧光定量PCR无需内标实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：
　　1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。（见图4）
　　2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。
2．内标对实时荧光定量PCR的影响若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。
　　美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方法。
　 Applied Biosystems公司的7700型实时荧光定量PCR仪是全球公认的荧光定量PCR的金标准，可实现多色荧光同时检测，但定量检测仍然采用外标准曲线的方法，而不用内标进行定量。
　　综上所述，利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。

实时荧光定量PCR原理和实验见 cuturl('http://www.daangene.com/docc/gene/010/006.htm')

作者: 阿福 时间: 2011-9-15 15:06

TaqMan探针我曾问过价格（没买过）报价为2000元/条

作者: 阿福 时间: 2011-9-15 15:07

7900HT型荧光定量PCR仪的主要特点

高效平台
7900HT系统是为支持高通量而构建的，光学系统经优化以适用于384孔板荧光信号的激活和实时检测。在8小时运转中，用老一代的系统作实时定量，可以操作5块96孔-板。7900 HT系统的通量则超过4倍。若用连续24小时工作的自动加样仪，通量又可增加10倍。

结果可靠
7900HT系统采用了与7700、5700相同的定量原理，利用Ct值（Ct定义为在基线上方产生可检测到的统计学上显著的荧光发射的这一PCR循环）和起始拷贝数的对应关系，通过外标准曲线精确计算未知样品的起始拷贝数。

高度重现性
7900HT系统的荧光检测发生在PCR对数期的起始，因此反应管中各组分没有任何限制反应因素，从而确保检测结果都是精确并能重复的。

先进的荧光检测技术
ABIPRISM® 7900HT荧光定量PCR系统在不降低速度、分辨率的情况下有效提高了产率，这是基于先进的荧光检测技术：一束激光扫描并激活384个孔的每一个孔里的荧光染料，荧光信号通过光栅分光，经过分离的多色荧光同时到达CCD摄像机，实现多色荧光同时检测。

自动进样装置
7900HT系统配备有自动化配件可取得最高效率。自动化装置可容纳84块384孔板，机械手臂可按一定顺序将待测样品板运送至主机内，配备的条形码阅读器（Bar code reader）可自动识别进入主机的样品板编号，使你在任何时间可以在样品行列中插入或替代样品板。

作者: 阿福 时间: 2011-9-15 15:07

多样的化学试剂
7900HT型荧光定量PCR仪上可使用的化学试剂包括TaqMan荧光探针法和SYBR Green荧光染料法。TaqMan探针法具有高度的灵敏度和特异性，适用于实时定量的多重反应或单核苷酸多态性分析（SNP）。SYBRGreen染料应用于目标鉴定（筛选测定）或者在只需用少数几个反应的测定中最为理想。
TaqMan探针法原理：
1. 聚合在Taq Man探针的5'和3' 端分别连接一个荧光报告（R）染料和一个淬灭物（Q）正向引物探针反向引物
2. 链置换当探针完整时，报告染料发射的荧光被淬灭。
3. 裂解在每一次延伸循环中，DNA多聚酶将探针上的报告染料裂解出来。
4. 聚合完成报告染料一旦与淬灭物分离即发出它特有的荧光。

SYBR Green染料法原理
1. 开始反应当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。
2. 变性当DNA变性时，SYBR Green染料便释放出来，荧光急剧减少。
3. 聚合在延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。
4. 聚合完成当聚合完成时，SYBR Green染料与双链产物结合，用7900HT系统测量时，荧光的净增量加大。

有效防污染
7900HT系统在PCR全过程中使用专门设计的和始终密闭的样品管。在加入样品和试剂后这些管子便立即封闭并在扩增和检测过程中保持这种状态，这样就可以大大地减少污染的机会；此外，7900HT系统不存在PCR后处理，有效防止扩增产物对实验环境的污染而造成的假阳性。

多种定量方法
ABIPRISM® 7900HT序列检测系统软件为基因表达提供一种定量化方法。绝对定量是从一个标准曲线上直接测定目标（基因）的量。相对定量方法是通过与标定样品相比较而计算未知样品的量，不需要标准曲线。

绝对定量
为了测定未知样品中的目标（基因）的数量，7900HT系统可用来测定样品的CT，然后用一条标准曲线来测定起始的拷贝数。在标准曲线的绘制中，7900HT系统软件首先用已知的起始拷贝数的几种稀释度计算它们的CT值。接着，软件使用测得的CT值对应于起始拷贝数的对数值作图。至少在五个数量级范围中两者呈线性关系。

作者: 阿福 时间: 2011-9-15 15:08

相对定量
对于基因表达研究来说，相对定量是理想的方法。这里不是应用标准曲线而是相对于标定样品计算表达水平。用一个内源对照来标定样品的量。这一方法与7900HT系统在一个多重反应中能同时对目标和内源对照进行定量测定的能力相结合，可实现高效、高通量的基因表达研究。

有效的SNP检测手段
除实时定量测定以外，7900HT系统包括对于已知的单一核苷酸多态性（SNPS）作大规模筛选的软件。在一对等位基因系统中，用对应于两个等位基因的两个TaqMan探针在同一个试管中做多重PCR反应。反应终止时所产生的荧光用7900HT系统进行测定，实验结果通过分析软件迅速取得。

软件界面友好易操作
软件包括样品表的设定、PCR循环条件以及结果分析，实验结束后数据就可以进行分析并显示结果，包括样品表的设定、原始光谱图、定量结果表格以及扩增曲线。

作者: 阿福 时间: 2011-9-15 15:08

7000型荧光定量PCR仪的主要特点

高度的实用性

ABI Prism® 7000型荧光定量PCR仪操作更快捷、更方便

● 多色荧光检测
● 实时数据监控
● 熔解曲线实时显示分析
● 简化的等位基因型判定（用于 SNPs分析）
● 阴性/阳性结果自动判定
● 节省空间的设计

突出的精确度和准确度

7000型荧光定量PCR仪采用精确的光学原理和复杂的多组分算法，可准确地检测和处理PCR指数级扩增的数据，得出高精度高重现性的Ct值（Ct值与起始拷贝数有线性关系）。

性能可靠

7000型荧光定量PCR仪的装机指标：使用TaqMan®的RNase P仪器检测板，7000型荧光定量PCR仪能够区分5，000和10，000的模板拷贝数的差异，其置信度可达99.7%

作者: 阿福 时间: 2011-9-15 15:09

多色荧光检测系统

在反应过程中，7000型序列检测系统的96个样本孔被卤钨灯激发，产生的荧光通过光学滤镜到达CCD照相机,通过过滤轮能够有效地分辨包括FAM™/SYBR® Green I, VIC™/JOE™, TAMRA™,和ROX™在内的多种荧光染料。多色荧光检测技术可实现多重定量、SNPs基因型分型和带有内部阳性对照的阴/阳性分析成为可能。

RNase P扩增曲线...........A- FAM荧光标记的模板扩增图.........B- VIC 放大图

两种可选的化学试剂

ABI Prism® 7000型序列检测系统兼容两种化学试剂：
● 采用TaqMan® 探针的5'核酸酶检测方法可以提供优越的灵敏度和特异性，并且能实现多重反应。
● 对于靶基因鉴定或少量反应时，SYBR® Green I 染料是一种理想的化学试剂。

无需优化的反应设计

不管你选择何种化学试剂，7000型荧光定量PCR仪的分析指导方针能有效节省时间，并提供可靠的结果。不同靶基因无需分别优化扩增体系和参数，分析指导的基本组件包括：
● Primer Express®软件提供自动的引物和探针设计
● TaqMan® 和SYBR® Green I Master Mixes简化PCR加样
● 多种温度循环参数使你能在同一个样品板中进行不同的样品检测
● 缺省的引物和探针浓度设定无需分析优化

作者: 阿福 时间: 2011-9-15 15:10

7000型荧光定量PCR仪的多种应用

绝对定量通过测量样本的Ct值和采用标准曲线，可定量分析未知样品的起始拷贝数。标准曲线是通过计算稀释的已知拷贝数样本的Ct值而得出的。

已知标准品扩增图.......标准曲线.......

相对定量相对定量分析通过一个标准样本来计算表达水平，而不是使用标准曲线。使用内源性的对照来校正样品的加样量。

熔解曲线分析........

高分辨的SNP检测 7000型荧光定量PCR仪还能利用多色荧光检测单核苷酸多态性（SNPs）。

阴/阳性分析（终点分析）使用内部阳性对照（IPC），7000型荧光定量PCR仪可进行阴/阳性分析。由于每个待检测样品中都加入阳性对照品，可以有效防止假阴性的结果。

系统组成

7000型序列检测仪
l 半导体PCR仪
l 卤钨灯光源
l 四方位的滤镜轮和CCD照相机进行荧光检测

笔记本电脑
Pentium Ⅲ 1.0GHZ处理器，256MB内存，20GB硬盘，CD-RW，15英寸UXGA彩色显示器，Windows®2000操作系统。

定量PCR仪软件
l 软件运行于Windows?2000操作系统环境下，可进行指令控制、数据收集及数据分析。

安装说明
在使用TaqMan®的RNA合成酶P仪器安装板的情况下，7000型序列检测系统能够区分5，000和10，000模板拷贝数，其置信度高达99.7%。

作者: 阿福 时间: 2011-9-15 15:10

试剂和消耗品
ABI Prism® 7000型序列检测系统有一整套的试剂和消耗品。

TaqMan®基因表达分析试剂盒
提供200多种基因表达和SNP检测分析试剂盒。

尺寸 ABI Prism® 7000型荧光定量PCR仪
宽度 39 cm(15.25in) 深度 51 cm(19.75in) 高度 53 cm(20.75in) 重量 34kg(75lbs)

笔记本电脑
宽度 33cm(13in) 深度 28cm(11in) 高度（打开）31cm(12.25in) 高度（关闭） 5cm(2in) 重量 3.6 kg(8lbs)

作者: 喵咪 时间: 2011-9-15 15:11

请问：现在有实时荧光定量VEGF的试剂盒吗？有VEGF标准品卖吗？价钱？
         TaqMan探针大概价格是多少？
         如果没有标准品用实时荧光该如何定量？
         测定时须内参吗？
         谢谢指教

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1.实时荧光定量VEGF可以自己合成，我们一般将序列设计好后交给浩嘉公司合成，TaqMan探针大概价格1200RMB。
2.如果不需要绝对定量，则不需要标准品，可以作相对定量，具体方法是取其中一个表达水平的较高的样本倍比稀释，作标准曲线，其他样本与之作对照即可。事实上这样可满足大多数科研要求。
3.测定时当然需要内参照，常用的有GAPDH、B-actin等等，各有利弊。

作者: 韩梅梅 时间: 2011-9-15 15:12

TaqMan探针我用过，用Probe was 5' end labelled with 6-carboxyfluorescein (FAM) and 3' labelled with 6-carboxy-N,N,N',N'-tetramethylrhodamine (TAMRA). 大概是1500左右，上海生工有合成和标记服务
你也可以用SYBR Green I 染料，可能更简单的

作者: 菠萝喵 时间: 2011-9-15 15:12

谢谢以上各位的指教。
我想问一下verygood:你说的是自己合成标准品吗？该标准品为待测基因片段吗？
如果说扩的目的片段有几百个bp，就合成这么长吗？那价钱可就贵了。
你说的相对定量，结果用什么表示？用相对稀释倍数吗？

作者: 喵咪 时间: 2011-9-15 15:13

谢谢以上各位的指教。
我想问一下verygood:你说的是自己合成标准品吗？该标准品为待测基因片段吗？
如果说扩的目的片段有几百个bp，就合成这么长吗？那价钱可就贵了。
你说的相对定量，结果用什么表示？用相对稀释倍数吗？

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相对定量不需要标准品，扩增的只是目的片段一部分，不用全部合成，只需要两个引物和一个探针。
标准品用于制作标准曲线，你若不需要知道绝对量，以其中一个表达量较高的样本倍比稀释一样可制作标准曲线，不过数值是相对值而已，并不影响结果的判断。但如果是商业化的检测，需要进行不同时期对比，则最好绝对定量（比如检测病毒的拷贝数，你不能告诉病人他的体内病毒拷贝数是另外某人的几分之一，而应该告诉他有10的几次方个）。

作者: panda王 时间: 2011-9-15 15:13

我想用real-time RT-PCR 的方法检测疾病的相关差异基因．１．将同一个患者的不同部位的组织的同一个基因的表达量进行比较．２．将患者与正常人的同一部位的组织的该基因的表达量进行性比较．我想问的是做第一组试验是仅是比较表达量的差异，只是用SYBR Green染料将目的基因和内参进行一个相对定量就可以了吗？那么再做第二组试验时，我还能直接用这种相对定量的方法吗？是不是必须定制探针来进行绝对定量？因为我最后的目的是想证实该基因与患者的发病机制有密切关系，在正常人和患者之间寻找到差异，为诊断和治疗寻找依据．请赐教，谢谢！

作者: 丸子妹 时间: 2011-9-15 15:14

PE7000是不错
价格多少？
我要成交价！
谢谢！

作者: 菠萝喵 时间: 2011-9-15 15:15

请问:
若不需要知道绝对量，以其中一个表达量较高的样本倍比稀释制作标准曲线,还需要做内参吗？如果要内参那不是需要两个探针吗（一个为目的片段的，另一个为内参的）

作者: 冰激凌小姐 时间: 2011-9-15 15:16

我想向各位高手请教一问题:实时荧光定量PCR的目的基因最好在250bp附近吗?如果300-400bp行吗?多谢指点.

作者: 冰激凌小姐 时间: 2011-9-15 15:17

再一次，我想向各位高手请教一问题:实时荧光定量PCR的目的基因最好在250bp附近吗?如果300-500bp行吗?多谢指点.

作者: 8黑眼圈8 时间: 2011-9-15 15:17

请问喵咪君：采用荧光定量PCR比较两个样本的差异时，一般差异多少倍才认为是有意义的差异，即仪器的精密度能达到多少？

作者: 喵咪 时间: 2011-9-15 15:18

7000型荧光定量PCR仪的装机指标：使用TaqMan®的RNase P仪器检测板，7000型荧光定量PCR仪能够区分5，000和10，000的模板拷贝数的差异，其置信度可达99.7%

[ 本帖最后由喵咪于 2011-9-15 15:20 编辑 ]

作者: 喵咪 时间: 2011-9-15 15:19

QUOTE:

原帖由喵咪于 2011-9-15 15:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问very good 君：采用荧光定量PCR比较两个样本的差异时，一般差异多少倍才认为是有意义的差异，即仪器的精密度能达到多少？

7000型荧光定量PCR仪的装机指标：使用TaqMan®的RNase P仪器检测板，7000型荧光定量PCR仪能够区分5，000和10，000的模板拷贝数的差异，其置信度可达99.7%

作者: =菓子= 时间: 2011-9-15 15:20

请教喵咪君，可有7000型荧光定量PCR仪的使用经验，如有可否指教？

作者: @花开花落@ 时间: 2011-9-15 15:21

ABI 7000的价钱现在应该在4.8-5万美金。7000型的卢钨灯寿命较短，一般只有200小时左右，原因是其发射功率很大，这样其检测时所需能量较低，故灵敏度高。做实验时最好用ABI的荧光定量PCR试剂盒，效果好，但价格昂贵，平均每管10元RMB，但做一块板最多是96孔，还要做重复实验，开销很大。（其他仪器定量PCR也差不多）故一般在普通PCR仪上把条件摸的差不多时才上定量。

关于标准品的制备一般有两种办法：
1、扩增目的基因片段，纯化后比色定浓度，然后按梯度稀释
2、扩增目的基因片段，纯化后接入TA克隆，做成质粒，比色，算颗粒数，要引入阿佛加德路常数，好象是6.23X10 23次方
但是做的标准品和你的模板还是有差距的，其目的基因片段的扩增效率是不同的，这可能就要引入内参了。

作者: 微笑的海豚 时间: 2011-9-15 15:22

TaqMan probe 大概是1500元一条,自己设计好,于公司帮标记荧光(FAM,TARMAN)

作者: 喵咪 时间: 2011-9-15 15:23

请教喵咪君，可有7000型荧光定量PCR仪的使用经验，如有可否指教？

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俺们用的是7900，除检测样品量多及节省试剂优于7000外，其他两者应差不多。

作者: 回眸 时间: 2011-9-15 15:23

我最近就要做real-time PCR,想请教自己做标准曲线的朋友，制作标准曲线的具体步骤及需要特别注意的地方，谢谢了，现在是一头雾水啊

作者: 微笑的海豚 时间: 2011-9-15 15:24

做real-time PCR标准曲线首先要保证标准品的纯度，我的做法是先在普通PCR上扩增 cDNA跑电泳，将含特异性目的条带的胶切下来回收，并再扩增一次跑电泳验证其特异性，然后用胶回收的产物倍比稀释上real-time PCR作标准曲线。当然，这样的标准品用于绝对定量无法排除RT中种种因素的影响，且其本身难以准确定量。

作者: 回眸 时间: 2011-9-15 15:24

谢谢了，不过的确如你所说，如果这样做其实是不知道标准品的准确定量的。在上面ff提过可以利用Ta 克隆来制备标准品，不知道其定量的准确性多大。另外还想问问，如果我想用TaqMan探针法，除了探针和引物的制备外，其他试剂还需要准备什么（我不想买试剂盒来做，听说加入探针后的过程和一般的PCR过程类似），总的价格是多少啊

作者: 椰子叶子 时间: 2011-9-15 15:25

我不知道你是否一定要做绝对定量，在很多情况下，相对定量已经足够了。不知你看过下面这篇综述否？如果没有看过，我有全文，下次我把链接贴在这里。Bustin S.A.Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J. Mol. Endocrinol.2002 May-Jun; 23(3):130-8

作者: 回眸 时间: 2011-9-15 15:25

我是一定要做绝对定量的，非常希望能够得到指导。那篇文章我没有看过，很想看看，先谢谢了啊。

作者: 椰子叶子 时间: 2011-9-15 15:26

http://journals.endocrinology.org/jme/029/0023/0290023.pdf
Bustin S.A.Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J. Mol. Endocrinol.2002 May-Jun; 23(3):130-8

作者: 回眸 时间: 2011-9-15 15:29

谢谢椰子叶子，文章我已经看过了，很有帮助。
各位做探针法的朋友，可否给点建议或心得啊，我很是需要！！！

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