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标题: 【求助】细胞免疫荧光步骤 [打印本页]

作者: 079777chao 时间: 2015-9-12 14:45 标题: 【求助】细胞免疫荧光步骤

希望热心战友能够提供细胞免疫荧光的具体步骤以及需要的主要试剂与耗材

作者: 079777chao 时间: 2015-9-12 14:47

细胞爬片免疫荧光实验步骤
第一天：
1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；
2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min；
3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；
4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；
5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；
第二天：
6. 加荧光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；
注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。
7. 复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；
8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

作者: zhy平平 时间: 2015-9-12 14:47

DAPI染后不用洗吧

作者: 079777chao 时间: 2015-9-12 14:47

QUOTE:

原帖由 zhy平平 于 2015-9-12 14:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

DAPI染后不用洗吧

这个我不太清楚啦，这是别的站友发给我的细胞免疫荧光步骤，我自己还没有做过，我就是把它放上来分享一下，也让有经验的站友看看是不是合适，看来你是做过免疫荧光啦，那具体的步骤是不是就是这样的呢？

作者: newway 时间: 2015-9-12 14:48

这个步骤是我写的，我这样做了N次了，几乎都是屡试不爽啊

作者: 花想容 时间: 2015-9-12 14:50

QUOTE:

原帖由 zhy平平 于 2015-9-12 14:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

DAPI染后不用洗吧

Dapi染后必须得洗，否则蓝色特别重

作者: 莲花白 时间: 2015-9-12 14:50

细胞爬片免疫荧光实验步骤
第一天：
1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；
2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min；
3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；
4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；
5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；
第二天：
6. 加荧光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；
注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。
7. 复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；
8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
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请问培养板和湿盒都要消毒吗?不好意思，问题比较简单，见笑了。

作者: 莲花白 时间: 2015-9-12 14:50

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原帖由 newway 于 2015-9-12 14:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

这个步骤是我写的，我这样做了N次了，几乎都是屡试不爽啊

请问培养板是什么?应该不是二十四孔板吧？它的作用是什么呢?

作者: newway 时间: 2015-9-12 14:51

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原帖由 莲花白 于 2015-9-12 14:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问培养板是什么?应该不是二十四孔板吧？它的作用是什么呢?

我所说的培养板就是指6孔板或12孔板，这个只是在做免疫组化的过程中好放爬好细胞的玻片而已，培养板和湿盒都不需要消毒的，其实做免疫组化没得哪一步需要用灭过菌的耗材。

作者: 阿k 时间: 2015-9-12 14:53

请问如果蛋白在细胞膜与细胞质里都有，加Triton x 100会不会有影响？
细胞膜上会不会有荧光呢？

作者: 大桃子同学 时间: 2015-9-12 14:53

亲，我也在做免疫荧光，结果一直不好，，很焦躁。。请问DAPI你们是怎么配置的？复染后需不需要洗啊。。谢啦谢啦~~

作者: 079777chao 时间: 2015-9-12 14:54

DAPI是直接从试剂公司买来直接就用的，复染后稍微洗一下没关系的

作者: am10 时间: 2015-9-12 14:54

奥，，谢啦~~我的DAPI 买的是浓缩的需要自己配置。

作者: am10 时间: 2015-9-12 14:55

这个步骤是我写的，我这样做了N次了，几乎都是屡试不爽啊

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请问，我是直接在96孔版做的，没有加抗荧光淬灭剂，发现很快就消失了荧光，我的二抗是PE的。请问你的荧光可以维持多久呢？

作者: newway 时间: 2015-9-12 14:57

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原帖由 am10 于 2015-9-12 14:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
这个步骤是我写的，我这样做了N次了，几乎都是屡试不爽啊

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请问，我是直接在96孔版做的，没有加抗荧光淬灭剂，发 ...

PE标记的二抗我没用过，其他荧光二抗我用的比较多，一般我用进口的抗淬灭封片剂封片后荧光片子放在冰箱几个月都不会淬灭，当然，如果本身做出荧光片子在镜下看就很微弱的话就保存的不会太久。之前没用抗荧光淬灭封片剂封片的片子也能保存好一段时间的，一般也不会说2-3天就全淬灭了。

作者: am10 时间: 2015-9-12 15:02

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原帖由 newway 于 2015-9-12 14:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

PE标记的二抗我没用过，其他荧光二抗我用的比较多，一般我用进口的抗淬灭封片剂封片后荧光片子放在冰箱几个月都不会淬灭，当然，如果本身做出荧光片子在镜下看就很微弱的话就保存的不会太久。之前没用抗荧光淬灭封片剂封片 ...

封片剂是可以直接滴加在样本上的是吗？那我也可以直接加在96孔板上，然后不用玻片盖上了？我当时观察就是觉得奇怪，在前几min都看到了红色的膜染色的荧光，但是后面就没看到了。那么再问一下，一抗4°过夜和37°2h那个比较好呢？

作者: newway 时间: 2015-9-12 15:02

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原帖由 am10 于 2015-9-12 15:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

封片剂是可以直接滴加在样本上的是吗？那我也可以直接加在96孔板上，然后不用玻片盖上了？我当时观察就是觉得奇怪，在前几min都看到了红色的膜染色的荧光，但是后面就没看到了。那么再问一下，一抗4°过夜和37°2h那个比较好呢？ ...

封片剂是直接滴加在样本上的，在96孔板上做的话没必要封片了，也没必要滴加封片剂。普遍认为一抗4摄氏度过夜效果要好于37摄氏度2h。

作者: luoliqiong 时间: 2015-9-12 15:02

将对数生长期细胞传代，37℃、5%CO2培养24h；800 r/min离心5min, 分别用等体积培养基悬浮细胞：control组、实验组，37℃、5%CO2培养2h；800 r/min离心5min，无钙镁PBS洗3次；4%多聚甲醛悬浮细胞，固定1min；取细胞固定液15~20?l均匀涂于处理好的爬片（0.1 mg/ml多聚赖氨酸处理30min，去离子水洗涤后置于烘箱中过夜备用）上，自然晾干；无钙镁PBS洗涤3次；0.2%~0.5% triton X-100透化细胞10min；无钙镁PBS洗涤3次；2% BSA（牛血清白蛋白）37℃封闭30min；去除封闭液，加入一抗稀释液，37℃孵育1h；无钙镁PBS洗涤3次；加入二抗稀释液，室温避光孵育1h；无钙镁PBS洗涤3次，蒸馏水洗涤1次；滴加抗荧光淬灭封片液（甘油：PBS之比为1:1）封片；将做好的玻片至于正置双光子共聚焦显微镜下观察。

作者: bring 时间: 2015-9-12 15:09

PE标记的二抗我没用过，其他荧光二抗我用的比较多，一般我用进口的抗淬灭封片剂封片后荧光片子放在冰箱几个月都不会淬灭，当然，如果本身做出荧光片子在镜下看就很微弱的话就保存的不会太久。之前没用抗荧光淬灭封片剂封片的片子也能保存好一段时间的，一般也不会说2-3天就全淬灭了。

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请问大神~你用的是什么封片剂？直接滴到细胞爬片上然后正面朝下固定在载玻片上面？
放冰箱保存的话是4度么？
然后~如果我直接在24或者96孔板上铺细胞，后续加抗体什么的都直接往里面加，可以往里面加防止猝灭的封片剂么？（之前都是在里面加pbs就算了然后直接拿到镜下去看。拍照的时候都怕没拍完荧光就没了）

作者: pou 时间: 2015-9-12 15:10

细胞爬片免疫荧光实验步骤
第一天：
1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；
2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min；
3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；
4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；
5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；
第二天：
6. 加荧光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；
注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。
7. 复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；
8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
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前辈，你好。我想问下，如果是已经标记荧光（比如FITC、APC等）的抗体去染细胞膜上的抗原的话怎么做？

作者: newway 时间: 2015-9-12 15:10

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原帖由 pou 于 2015-9-12 15:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
细胞爬片免疫荧光实验步骤
第一天：
1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；
2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min；
3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min（细胞膜上表达的抗原 ...

染细胞膜抗原的话就不用破膜，省略掉第3步，既然一抗自带荧光标记，那么第6步也就可以省略了，其余步骤都不变即可。

作者: pou 时间: 2015-9-12 15:10

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原帖由 newway 于 2015-9-12 15:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

染细胞膜抗原的话就不用破膜，省略掉第3步，既然一抗自带荧光标记，那么第6步也就可以省略了，其余步骤都不变即可。

我再多问几个问题，1.加上正常山羊血清的目的是什么，我没有山羊血清的话这一步可不可以不做？2.后面用PBST洗片，可不可以用PBS代替？

作者: 079777chao 时间: 2015-9-12 15:11

请问培养板和湿盒都要消毒吗?不好意思，问题比较简单，见笑了。

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这个不需要哦，只有细胞培养的时候需要无菌，免疫荧光都不用消毒的

作者: ldh 时间: 2015-9-12 15:11

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原帖由 pou 于 2015-9-12 15:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我再多问几个问题，1.加上正常山羊血清的目的是什么，我没有山羊血清的话这一步可不可以不做？2.后面用PBST洗片，可不可以用PBS代替？

1.封闭非特异性的能与二抗结合的抗体，山羊血清加上后可减轻背景，没有的话可以用1%-5%的BSA(可用PBS，溶解，稀释），还在园子里见到用FBS封闭的，其实主要就是要血清或者蛋白结合非特异位。
2.是可以的，pbst，中是pbs加入TWEEN20,根据实验内容需要。

作者: dog002 时间: 2015-9-12 15:14

我要做免疫荧光双标记，一个在细胞膜，一个在胞内，这个还要Triton透化吗？透化会对膜上的有影响吗？我主要是看胞内蛋白转移到细胞膜与膜上的蛋白结合。请各位大侠指教。

作者: 生物迷 时间: 2015-9-12 15:17

回复楼上战友，我研究的是外源加入的一种蛋白和细胞膜上一种受体蛋白结合，因为不涉及胞质中的成分，我固定之后直接封闭，不做通透（通透可能会破坏膜上受体结构）。
对于你的实验，我觉得可以选择通透，因为通透之后有助于抗体进入胞质中并表达出荧光。之前我做过膜上受体蛋白单标荧光，从荧光照片上看通透之后照的照片依旧很漂亮。（当然对在胞膜上高表达受体蛋白可能影响较小，如果是低表达的膜受体可能影响较大），以上纯属个人见解，仅供参考。

作者: xue258 时间: 2015-9-12 15:17

请问你们有没有出现过染色体通道很多杂质，刚开始上汞灯时很干净，几分钟后就出现杂质然后越照越亮的情况？其它通道很干净。之前一直都好好的，最近几个月老这样

作者: 气泡 时间: 2015-9-12 15:19

这个步骤是我写的，我这样做了N次了，几乎都是屡试不爽啊

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前辈。我是把细胞接种到不透光的陶瓷材料，再进行免疫荧光。步骤和上面差不多，为什么啥都看不见呢？

作者: xyw5 时间: 2015-9-12 15:22

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原帖由气泡于 2015-9-12 15:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
这个步骤是我写的，我这样做了N次了，几乎都是屡试不爽啊

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前辈。我是把细胞接种到不透光的陶瓷材料，再进行免疫荧光。步骤和上面 ...

细胞能看见吗

作者: 气泡 时间: 2015-9-12 15:25

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原帖由 xyw5 于 2015-9-12 15:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

细胞能看见吗

细胞也看不见

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