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标题: PCR产量很低，弱弱的一条带，我怎么办？ [打印本页]

作者: coolcool 时间: 2011-9-16 13:10 标题: PCR产量很低，弱弱的一条带，我怎么办？

PCR产量很低，弱弱的一条带，我怎么办？ [转载]

七百多碱基，共50微升的反映体系，我取20微升上样，才看见弱弱的一条带，产量太低了，请教高手我该怎么办？

作者: fangxiang 时间: 2011-9-16 13:10

you can do pcr using the former diluted pcr products if your products is purify enough.

作者: 喵咪 时间: 2011-9-16 13:11

换一种酶试试看。
或者看看加大循环次数是否有用。

作者: 格格巫 时间: 2011-9-16 13:11

做个次级pcr：取你的pcr产物1uL做模板，另做一个体系扩增。

作者: 小葵 时间: 2011-9-16 13:11

首先确定是否PCR体系可靠，如果用相同体系做其他PCR，例如管家基因都没问题，就要调整目前PCR的退火温度，并核对引物保存、模板是否可靠。

如果该PCR体系连管家基因等都拉不出，就重新换试剂吧，首先要考虑更换的是Taq 酶和dNTP。

个人意见：不主张用弱带纯化产物二次PCR，虽然第二次PCR条带大小相符，但实际序列是错误百出。这与用PCR 主带产物二次PCR是完全不同的。

再试试看，祝好运。

作者: 冷眼相对 时间: 2011-9-16 13:12

肯定是你的体系有问题。PCR产物一般5微升就可以看见很亮的带了.你应该在摸一下条件。看看模板量，退火温度等，另外你的酶是什么？看看是不是在你的温度下他活性不好。你这么长的片段，还是用Pfu比较好，保真

作者: 韩梅梅 时间: 2011-9-16 13:12

降低模板浓度！

作者: babybabe 时间: 2011-9-16 13:13

我认为你的反应体系有问题:应先摸一下条件然后换其他的酶试一试.最好先用最差的酶!

作者: 小米虫子 时间: 2011-9-16 13:13

可以降低退火温度;重新设计引物;增加模板量.

作者: 嘉年华 时间: 2011-9-16 13:14

多做几次，（换温）
摸摸条件

作者: 森林木 时间: 2011-9-16 13:14

touchdown PCR可能管用

作者: 羊咩咩 时间: 2011-9-16 13:15

看看你的条件有没有问题

作者: 跳跳糖 时间: 2011-9-16 13:15

模板是什么？质粒还是天然的基因组模板
如果是克隆过的东西，建议优化条件，包括重新考虑引物
如果是天然低丰度模板，可以采用套式PCR扩增，产量和特异性都好

作者: 果冻也酸 时间: 2011-9-16 13:16

建议先用20ul体系试试！

因为有些国产的PCR反应管导热性能达不到要求，反应体系大了会有问题。

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