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标题: 【求助】opa法测18种氨基酸遇到的问题 [打印本页]

作者: wsll 时间: 2015-9-26 08:55 标题: 【求助】opa法测18种氨基酸遇到的问题

我按照A Vasanits文献上的方法测定18种氨基酸
用的opa/mpa方法
柱子是RESTEK 150 mm*4.6  保护柱20mm
solvent A 0。05 M醋酸钠
solvent B 0。1 M 醋酸钠:乙睛：甲醇＝46：44：10
流速 1。8 ml/min （文献先1。1 再2。1）
柱温 30 （文献上温度50）
如果按照该文献上的梯度洗脱程序
time B
0    1
14 9
17 35
20 35
24 45
26 100
29 100
31 0
40 0
我的大部分峰都出峰较晚，并且挤到一起了，而且峰也没有文献上那么窄
于是我改梯度洗脱程序为
time B
0    1
4 1
12 35
27 43
30 100
34 100
35 0
40 0
这样出峰要好不少，但是在24－26 min时有三个峰粘在一起（try，phe，i－leu）， 27－28的峰很宽
大概就是这样的图片点击可在新窗口打开查看
有几个问题想请教一下各位大大
1。我还需要怎样修改梯度洗脱程序？
2。文献上的最佳温度是50，但我发现温度升到40度的时候，峰型就不好看了，我温度需要保持30度么
3。对于solvent B的pH值，我是在加入有机溶剂以前调到7。2，还是加入有机溶剂以后到7。2？（加入有机溶剂以后不调pH值是8。3，乙睛由于制备方法偏碱性）
4。流速上需要做调整么？如果用2。1 ml/min的流速，压强就会超过3000
5。我的峰型比文献上宽，并且有三个峰粘到一起是否是因为柱子柱效不行了还是因为我死体积太大?
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更新：
十分感谢楼下几位色友的回答，目前我做了以下调整：
1。pH值是在加入有机相以前调。
2。更换了一根更长的柱子
3。改mpa为npa
分离度已经得到很大提高，不过捏，还是跟文献上有一些区别
温度是30。c，流速1。8（怕流速太高毁柱子）
还有一点问题就是thr和gly完全分不开，还有就是solventb在达到45％时就已经出峰完全了，我需要降低乙睛的用量而加大甲醇的用量么？

作者: loli 时间: 2015-9-26 08:55

这种分离不好的原因大都是pH的原因，一定要调的很准确，应该是加有机溶剂之前调。

作者: wsll 时间: 2015-9-26 08:55

QUOTE:

原帖由 loli 于 2015-9-26 08:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

这种分离不好的原因大都是pH的原因，一定要调的很准确，应该是加有机溶剂之前调。

谢谢啦明天试试
不过加有机溶剂后 pH值又会变高了

作者: vera+ 时间: 2015-9-26 08:56

你的那部分要调PH，因为你是走梯度，调你需要的那一相就可以了；
温度可能有影响的。我们一个西药，药典上用60度，因为温度太高，我们就用40度，但是一直做不好，最后用50度就好多了

作者: nn255 时间: 2015-9-26 08:56

目前我们所能为你提供的服务有：LC-MS/MS（液相串联质谱）检测服务，MALDI-TOF MS(飞行时间质谱仪)检测服务，FT-MS（傅立叶变换离子回旋共振质谱仪），核磁共振等。
一：氨基酸检测
17种氨基酸质谱检测服务
20种氨基酸质谱检测服务
22种氨基酸质谱检测服务
33种氨基酸质谱检测服务
42种氨基酸质谱检测服务
全谱氨基酸营养代谢组学检测与分析服务
特定氨基酸的订制检测服务
牛磺酸(Tau)检测服务
肌氨酸(Sar)检测服务
同型半胱氨酸(HCY)检测服务
支链氨基酸/芳香族氨基酸（BCAA/AAA）检测服务
必需氨基酸/非必需氨基酸检测服务
含硫氨基酸检测服务
尿素循环（鸟氨酸、精氨酸、瓜氨酸、精氨琥珀酸）检测服务
γ-氨基丁酸（GABA）检测服务
兴奋性氨基酸/抑制性氨基酸(EAAs/IAAs) 质谱检测服务
食品和饲料中游离氨基酸/水解氨基酸的精确定量检测 --液相串联质谱法（17种）
生物制品（细胞培养液、口服液等）中游离氨基酸的精确定量检测 --液相串联质谱法（17种和33种）
机体体液(血液、脑脊液、尿液)中游离氨基酸的精确定量检测 --液相串联质谱法（17种、33种和42种）
样本短肽的定性定量检测
同位素标记氨基酸质谱检测服务

作者: pore 时间: 2015-9-26 08:56

这是一关于流动相pH的问题。

氨基酸用OPA衍生后，剩下一个游离的羧基。要想得到一个比较好的峰形，pH应偏酸。梯度洗脱的时候，流动相pH稳定也很重要，醋酸钠，在中性偏碱的条件是没有缓冲能力的，这样，随着梯度的变化，pH也在改变。建议的使用范围是3.8-5.8，这样才能有比较好的缓冲能力，保持稳定的pH。建议用醋酸把A、B相都调到4.8以下。

这里，或者是你需要的资料：

cuturl('http://www.sepu.net/dvbbs/dispbbs.asp?boardid=176&Id=209623')

另外，氨基酸分析真的很挑柱子，不是所有的C18都能做好。各个公司都有很多种类型的C18，也都有一种或几种推荐用于氨基酸分析的色谱柱。

作者: BUK 时间: 2015-9-26 08:57

LZ这个峰很怪异啊，如果你的柱子和方法完全和文献中一样，并且能保证所用的衍生试剂，流动相试剂盒样品没问题的话，建议你先测试下柱效，保证柱子的状态正常，之后再看看你检测器的采样速率是否设的太低了，因为你用的流速太高，可能造成检测器采样丢点。理论上温度和ph不至于对峰型和分离有毁灭性的影响。。。

作者: wsll 时间: 2015-9-26 08:57

谢谢大大
其实我文献上的时间也只是25min，只不过我在25min内分离度达不到要求所以就只能延长分析时间

作者: wsll 时间: 2015-9-26 08:58

QUOTE:

原帖由 pore 于 2015-9-26 08:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
这是一关于流动相pH的问题。

氨基酸用OPA衍生后，剩下一个游离的羧基。要想得到一个比较好的峰形，pH应偏酸。梯度洗脱的时候，流动相pH稳定也很重要，醋酸钠，在中性偏碱的条件是没有缓冲能力的，这样，随着梯度的变化，pH也在改变 ...

嗯我现在换了跟安结论 250um的柱子，情况好了很多

作者: wsll 时间: 2015-9-26 08:59

QUOTE:

原帖由 vera+ 于 2015-9-26 08:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你的那部分要调PH，因为你是走梯度，调你需要的那一相就可以了；
温度可能有影响的。我们一个西药，药典上用60度，因为温度太高，我们就用40度，但是一直做不好，最后用50度就好多了
...

谢谢
嗯，我现在改成加有机相以前调，确实好了不少

作者: wsll 时间: 2015-9-26 08:59

QUOTE:

原帖由 BUK 于 2015-9-26 08:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
LZ这个峰很怪异啊，如果你的柱子和方法完全和文献中一样，并且能保证所用的衍生试剂，流动相试剂盒样品没问题的话，建议你先测试下柱效，保证柱子的状态正常，之后再看看你检测器的采样速率是否设的太低了，因为你用的流速太高，可能 ...

谢谢
那个图是用绘图板画的……图片点击可在新窗口打开查看实际上没有那么怪
大概是那样子，就是三个峰分不开

作者: wawa 时间: 2015-9-26 08:59

沃特斯和安捷伦都有自己的方法测氨基酸的，只要买他们色谱柱和消耗品就行了，检测的效果还可以，原来测脑蛋白水解也就是用的沃特斯的方法

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