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标题: 哪里的taq酶保真度高，还可以直接TA克隆 [打印本页]

作者: mamamiya 时间: 2011-9-16 16:38 标题: 哪里的taq酶保真度高，还可以直接TA克隆

哪里的taq酶保真度高，还可以直接TA克隆 [转载]

上次用Takara大连分公司的Extaq premix扩增750bp片度，然后TA克隆测序（上海博采）结果居然有30个碱基突变，只好重做，请教哪种Taq酶保真度高？应该用哪种？一般的高保真的Taq酶不能直接做TA克隆吧，呜呜，该用哪种呢？？？？？急急急急

作者: #甜# 时间: 2011-9-16 16:39

建议使用Qiagen公司的Proofstart Taq酶（基因公司代理），该酶是热启动＋高保真。可以扩增出很难扩出的片断。扩增出的PCR产物用PCR gel extraction kit（qiagen公司）胶上回收后，产物加入ATP 2ul，bufter及water，72度15min，POLY A 就加入PCR产物，那么就可以联入TA克隆。我做过这样的实验多次了，效果很好。还有，多次突变，你要好好寻找突变的规律，是不是同一个位点突变，那可能与酶保不保真关系不大（我遇到过这样的事情）。

[ 本帖最后由 #甜# 于 2011-9-16 17:31 编辑 ]

作者: 喵咪 时间: 2011-9-16 17:31

产物加A时要加taq酶吧
要不怎么加的上啊

作者: #甜# 时间: 2011-9-16 17:32

回复楼上的兄弟，加入POLY A需要TAQ 酶，但不影响保真度！

作者: 羊咩咩 时间: 2011-9-16 17:32

谢谢楼上的，具体用多少PCR产物回收，加入多少水，Buffer，ATP，Taq每呢？具体方案步骤，谢谢指点哟！！！！

作者: 喵咪 时间: 2011-9-16 17:33

你如果怕麻烦
上海生工有试剂盒买
"平端DNA片段添A试剂盒"

作者: 喵咪 时间: 2011-9-16 17:33

我也正做TA克隆

作者: blueeye 时间: 2011-9-16 17:34

为什么不考虑一下测序的准确性？？？有可能在测序时有错。 INVITROＧＥＮ的酶不错。

作者: she 时间: 2011-9-16 17:34

Qiagen的hotstar很好用.Taq自动在产物末端加A，用introgen的TA cloning kits，很方便，而且copy 数很高

作者: 夕阳 时间: 2011-9-16 17:35

利用Tag加A尾步骤：
1－7ul纯化后的PCR产物（由高保真酶扩增得到）
｜
1ul 10 X buffer (with MgCl2)
|
add d ATP (final concentrition 0.2mM)
|
add 5 Unit Tag
|
add water to 10 ul
|
70 度 15-30分钟
｜
1-2 ul for T-vector lignation

作者: 韩梅梅 时间: 2011-9-16 17:35

http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=281328&sty=1&tpg=2&age=0

作者: 小蜜蜂 时间: 2011-9-16 17:36

请问能保证只加一个A吗？

作者: 韩梅梅 时间: 2011-9-16 17:36

高保真的taq，里面只是混合了一些pfu，T/A克隆同样可以做
而且对750bp不应该产生如此多突变，你的退火温度提高一些
另:对测序结果怀疑ing

作者: 椰子叶子 时间: 2011-9-16 17:37

高保真与加A是一对矛盾，高保真酶具有3’-5‘外切活性，会把A切掉，绝大多数产物是平端。但是保真性要求是第一位的，加A操作是很容易的。

作者: 椰子叶子 时间: 2011-9-16 17:37

请问能保证只加一个A吗？

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当然，这是由酶的性质决定的
加A是聚合酶的不依赖模板的末端转移酶活性造成的，这种活性是在按照模板合成完互补链后在3’末端添加一个碱基。在ACGT四种核苷酸存在时，优先选择A。在只有一种碱基可供选择时，则添加该种核苷酸。
于是发明了利用平端酶线形化载体质粒然后用Taq酶加T的T-vector技术。

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