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标题: 【讨论帖】普通PCR技术 [打印本页]

作者: IAM007 时间: 2015-10-9 10:34 标题: 【讨论帖】普通PCR技术

咖啡者，香甘醇酸苦五味俱全，原始而又粗犷，深邃而又耐人寻味。
早期“科学咖啡馆”的雏型为J.J.汤姆森在19世纪末建立的卡文迪许物理学会，科学家每天午后茶时漫谈，他们谈他们看到、听到、测试、观察到的现象和发生的事件。卢瑟福在领导这个实验室时把午后茶漫谈变成他领导的科学家们每天最重要时刻。后来传于世的剑桥风格——“在悠闲中治学”、“自由和独立的工作”便源于此。
卡文迪许实验室为国际顶尖实验室，在物理、分子生物学方面培养了20多位诺贝尔奖获得者，和数以百计的优秀科学家，被誉为"现代物理学的发源地"。
PCR版开此咖啡吧，绝非奢望能望顶尖实验室之项背。PCR版只是希望借咖啡之名，网络广大战友，一同来畅谈实验经验、实验感受和实验生活。既能探讨科学，又能交朋访友，岂不快哉！

作者: bojitu 时间: 2015-10-9 10:34

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头痛
坐个沙发试试！！
在PCR专业版谈经验有点班门弄斧的味道，毕竟是新手上路。
暂且说一说自己将近一个月的PCR生活，希望和刚开始着手PCR的战友一起讨论一下
2008.4.1 自己经过几天的准备后终于开始了自己的pcr之旅，当时听师兄说过普通pcr其实难点就是提rna 和引物退火温度摸索。漫漫pcr摸索苦旅即将开始，而且我需要测三个指标，着手前是相当的头疼啊。
不过很幸运的是经过三周多的试验，自己三个指标还算顺利的完成。如果非得说一下经验的话，或许自己最得意的还是rna的提取，前一段时间已经在本版发过应助贴，如下
1. 加trizol前PBS是否洗涤，去除死细胞
2. 震荡时避免应用斡旋振荡器，以防破坏RNA全长
3. 4度离心15分钟，12000g/分
4. 取上清（一定要小心，避免枪头碰到下面白色层）
5. 4度离心10分钟120000g/分
6. 上下颠倒使rna块悬浮，洗涤rna块
7.离心5min，12000g/分离心
8.倒掉EP管中液体，一般情况下，放置一会，肯定会有较多剩余乙醇，小心用枪头吸出，用不着非得等到干燥（个人意见）。
9加30ul DEPC水稀释
总RNA的提取
在一个就是引物的设计和退火温度的选择。引物设计方面奉劝一些和我一样的新手，千万不要轻信文献上的引物序列，包括国外的文献；当然对他们的不信任是一个方面，另外还要考虑，试验条件的不同所引起的误差。自己可以在引物设计软件上如oligo 和 priemer 下些功夫自己设计，再者可以找公司设计，但也需要自己对设计原理及一些原则熟悉，便于分析。千万别忘了blast一下引物，看和你的基因序列匹配程度，及和其他基因非特异结合的情况。这些方法在园子里都可以搜索到
退火温度选择上，我是让takara合成的，由于我们实验室的pcr仪不能设梯度温度，一次只能取一个温度摸索，我就是取得合成报告单上两条引物退火温度的大约平均值的位置。结果全部出了结果，建议大家用takara合成的引物试一下。（师兄及其他高手说摸条件时一般情况是要比合成时报告的引物退火温度低4~5度，虽然有一定道理，不过我觉得并非定论）
一个和我一起跑的做了三次做出来，经验还是老一套，不过往往是在自己亲身经历后才能更理解：就是温度越低菲特异性就越高，特异性越低，但容易出目的条带；温度越高则相反。一旦没有目的条带，就得考虑降低温度（一般以2度左右为阶差），但非特异性条带出现的几率就更大了。
其他的除了操作方面规范，不要少加或多加了试剂（实验室里经常犯的毛病，毕竟pcr试剂盒的试剂种类还是有点炫目，呵呵），是不会出什么问题的。

作者: seagate 时间: 2015-10-9 10:34

本人前半年是做细胞培养的，现在就是提细胞的RNA，然后做反转录PCR。真是万事开头难啊。什么事都是不顺利的。首先准备配置去除RNA酶的DEPC水就够麻烦的。都说DEPC是剧毒物质，是致癌物，因为科里没有通风柜，为了减少危害只好在晚上人少的时候自己配制，把所有的窗户打开，白大衣，口罩，帽子，两层手套全副武装，但心里还是直打鼓。我第一次细胞RNA的结局以失败而告终。cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/11394759')。个人感觉做PCR真是比细胞培养的要求一点都不低啊，呵呵。现在想想，还是出了一些问题，例如我用的酒精就不是新启封的，而是前人剩下的，也不知是不是污染了，今后一定要换新的。对于PCR也是一头雾水啊，看了lanniaoxxx的帖子也是收益匪浅，引物是我参考的国外文献的，直接拿来就用了告诉公司合成，公司的速度也挺快，就是不知道质量怎么样，我也没有偶那个oligo 和 priemer 更不会blast，心里真的是没底啊，看来以后的路注定不平坦了，实验室里没有一个人做PCR，自己连PCR仪器的使用都还不熟悉，连编程都还不会，说起来真是惭愧啊。只能自己摸索了，以后会好好关注本版，努力向其他战友学习，把实验完成。

作者: bs4665 时间: 2015-10-9 10:35

支持开张！
正好做PCR，一起聊聊。
1.不要偷懒，实验尽量独立完成，我试过让别人帮忙的，但是似乎每个人手法不同，导致最后误差很大哦。但是我一个人做的结果还是蛮平行的。
2.关于污染，这种实验一定要戴口罩，手套，尽量有条件在超净台上工作。
3.离心的时候一定要配平，不然离心完了，实验也就完了Big Smile，本人见过离心机内一股青烟升上天空……
4.注意保护自己。
5.尽量固定试剂公司，有条件的实验室可以一次多买些，毕竟不同批号的也有一些差异。

作者: langlang 时间: 2015-10-9 10:35

本人前期做了2个多月的普通PCR，主要是做PCR－RFLP及AS－PCR测基因多态性SNP的，由于一切都是自己从头摸索的所以还是有一些心得和感受的，在此与大家分享一些。
1。首先是标本的收集和DNA的提取，我收集的是病人外周血标本，为了节省时间我将所收集的标本显放在－20摄氏度保存，最后将所有的标本一起提的DNA，最长的标本放置了有4个多月，但提取的DNA的质和量均较满意。
2。其次是做PCR了，个人感觉引物的设计和反应条件至关重要，我得经验是参考国外影响因子较高的文献中的引物和反应条件较可靠也省时，参考国内的还不如自己设计。
3。至于操作细节，个人感觉以下几点很重要:1.先加总体系后分装 2.取试剂前将试剂摇均 3.加入试剂后用枪头吹打数次 4.最后全部加完后放在振荡器上稍振荡一下（使体系混均），然后在离心机上离心数秒钟。5。使用PCR仪之前每次都要检测一下自己的程序有没有被改动。
4。至于污染问题，我感觉普通PCR的要求还是很松的，我用的均是进口的材料，所以无论枪头还是ep管均打开后直接用的，也没有戴口罩，帽子，更没有在超净台上操作，但跑出来的条带还是比较满意的。
在此声明，以上均为个人试验总结，若有不对的地方，也请大家给我提出宝贵意见。谢谢

作者: xuuuu 时间: 2015-10-9 10:35

我觉得PCR过程中，防止污染是很重要的一个工作。PCR只需几个DNA分子作模板就可大量扩增，应注意防止反应体系被痕量DNA模板污染和交叉污染，这是造成假阳性最大的可能。
（1）DNA处理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有缓冲液吸头、离心管等用前必须高压处理，常规消耗用品用后作一次性处理，避免反复使用造成污染。
　(2）PCR在超净台内进行，操作前后紫外灯消毒。超净台内设内供PCR用微量离心机、一次性手套、整套移液器和其它必须品；移液品用一次性吸头和活塞的正向排液器，防止移液器基部污染。
（3）PCR操作应戴手套并勤于更换，必要时应戴好帽子和口罩，就像做手术一样，要有“无菌观念”。
（4）成套试剂，小量分装，专一保存，防止它用。配制试剂用新器具，用后作一次性处理。
（5）试剂管用前先瞬时离心（10s），使液体沉于管底，减少污染手套与加样器机会。
（6）最后加模板DNA（包括在石蜡油后），马上盖好，混匀，瞬时离心（10s），使水相与有机相分开。加入模板且忌喷雾污染，所有非即用管都应盖严。加模板DNA后应更换手套。
（7）实验设阳性、阴性对照。
还有诸如：移液枪用完要放到最大计量位置，防止久了弹簧失活；防止RNA酶污染标本；低温下操作，防降解；试剂有致癌致畸作用，做好个人防护；头脑中各操作布骤要清楚，不要加错试剂；作完实验后水浴要关，冰盒里的冰要倒掉，不然漏电，发水灾的可能。暂时就想到这么多。

作者: greenbee 时间: 2015-10-9 10:36

1、做DNA的话标本不用-20℃保存也可，因为DNA很稳定，4℃甚至室温保存很长时间的标本都可以很好地提取出高质量的DNA。
2、做微量DNA提取时（如口腔粘膜、血斑等标本），用过国产的几种微量DNA提取的柱子，普遍效果不好。用伯乐的Chelex树脂提取方便又好用，用过国产的Chelex试剂盒效果不好，看起来颗粒明显的较伯乐的大，所以效果不好。
3、想省心的话可用Primer3在线设计软件，成功率比较高。专业点可用Oligo和Primer premier一起设计，尤其使用Oligo设计成功率高。
4、预防或消除污染可用稀酸擦拭试验台等，但注意不要用酸性液体擦拭移液器的金属部分和金属的实验台，以防腐蚀。

作者: tie8 时间: 2015-10-9 10:36

有个问题请教，不知道在这里问得是否合适。
如果想做PCR－RFLP试验，是否一定要做巢式PCR，如果普通PCR做出的条带很亮，是否不用再做巢式PCR？
请教各位高手了！

作者: wood533 时间: 2015-10-9 10:37

1.设计实验时要想清楚，要做好各种准备
2.记得做对照
3.样品多的话标签很重要，一旦弄错了，后果可能很严重
4.操作的时候尽量少说话或者不说话，保持头脑清醒，一旦多加了少加了某种试剂后果也可能很严重。
5.做RNA的话，RT之前都要千万小心无处不在的RNA酶。

作者: 2541 时间: 2015-10-9 10:37

不论做什么，都要认认真真的亲力亲为。
试过一次偷懒，提取RNA的时候请了一个外行的人帮忙研磨，结果那批结果都不好，也许说起来有点牵强，但自那以后我都是自己认认真真亲力亲为，就不再出现这种情况了。
总结了这么多次实验，只要是匆忙做的都结果不理想，只要是慢慢认认真真做的都基本上结果很好。
不要同一时间做两个不相干的实验，以为可以节省时间，实际上到头是吃力不讨好。也不要在自己状态不好的时候做这种精细的实验，很容易出错的。

作者: misswu61 时间: 2015-10-9 10:40

庆祝开张！
做PCR也有一段时间了，有成功也有失败，前面很多战友说到了自己实验中的一些心得，我非常赞同，下面是自己的一点经验，与大家分享：
PCR过程的第一步提取RNA是关键的关键，好的RNA等于实验成功了一半。有的组织富含RNA酶，因此提取的方法和一般组织不同。我做胰腺组织提取RNA开始的时候结果不好，后来采用一些措施后提高了RNA的质量。一是组织离体后迅速液氮速冻过夜，然后转如-70°保存。我们在剖杀动物的时候，取一个人取组织，另一个人完成立即液氮速冻，不要等到全部的组织取完后一起速冻（个人感觉这样不好，尤其是对胰腺组织）。二是采用RNA保存液。RNA保存液很多公司都有，国外的很贵，国内的公司价格我们可以接受，效果也不错。注意RNA保存液的使用方法（说明书上有详尽的解释），我感觉其中最重要的2条是：a：组织一定要浸没到保存液中。4°过夜保证组织被保存液完全渗透，达到抑制内源性RNA酶的效果，然后可以选择更低的温度保存；b：组织保存前应该削剪成小块（有利于液体渗透），注意保存液与组织体积比例（1：10），这个比例我想应该是利于液体渗透吧。上述2种保存组织的方法我都试过，结果还不错。
个人感觉组织匀浆还是一个一个完成最好，先从-70°取出一个标本完成匀浆，然后再做下一个标本。不要同时完成多个匀浆。切忌提取RNA质量比速度重要的多！一份好的RNA可以节约你很多时间和精力。完成匀浆的组织样本放在trizol里面是安全的，因为trizol里面也含有RNA酶的抑制成分。
最后，RNA沉淀溶解后需要测定OD260、OD280以明确其浓度和质量。我们实验室做RT和PCR都是采用成品的试剂盒，试剂盒最大的优势是条件和材料已经配置好了，直接按照操作说明进行即可。其中RT一步规定了RNA的用量，因此测定OD260明确RNA浓度后是为了决定RNA的用量，这一步骤很关键，千万不要嫌麻烦，因为做好了RT才能得到好的cDNA嘛！
其余的步骤没有什么说的了，总之我感觉PCR关键是前面标本的保存，高质量RNA的提取以及定量，只要前面的RNA保证了质量，RT得到好的cDNA，后面PCR的过程相对容易一些。如果前面的过程没有质量保证，后面结果不如人意的时候，分析原因就比较复杂了。所谓磨刀不误砍柴就是这个道理。

作者: ending 时间: 2015-10-9 10:40

一点感受
PCR这东西奇怪的很，让人既明白又糊涂，没法让人琢磨透。刚工作时，自觉着做了几年PCR，对PCR了如指掌，信心百倍给研究生指导实验，没过多长时间发现曾经是那样熟悉的PCR变得如此的陌生，从此不再对外称是PCR专家，我相信即便是天才Mullis也不会自称是PCR专家的。
后经分析，虽然绝大部分问题能自己解决掉，但是还有一部分问题依然困惑着我。
我觉得PCR不在于是不是能扩增出带来，而是在于是不是有重复性、是不是有统计性、有没有设对照，其实这3点做任何实验都需要的，尤其是对照，前两点对分析单次实验结果可能影响不大，但对照就不一样了，如果PCR有问题，没有对照很难分析原因的，即便是PCR出的带很好，没有对照也无法说明是不是假阳性，关键还是对照。但我了解，好多学生往往省掉了对照。但我建议做PCR至少要加一个阴性对照，再加的话加阳性对照，单引物对照。阴性对照设定也有学问，好多都是直接拿水替代模板，如果是RT-PCR的话，我都是拿RT时的阴性对照（不加逆转录酶的反应）做PCR时的阴性对照，再加水阴性对照。如果提取总RNA中有基因组污染的话，很容易识别了。
祝大家好运

作者: Darcy 时间: 2015-10-9 10:41

谈点我自己的心得
做PCR也有半年多了,感觉做RT-PCR比普通PCR难多了,做RT-PCR的过程中出现了许多的问题,比如重复性差,有抹带等.我个人觉得好的RNA是最重要的,楼上已经谈了提RNA的注意事项了,我就不多说了.重复性差还是由于模板量少.看文献上做我这个基因反转录RNA要1ug就够了,cDNA加1ul,但我反复试的结果是加到2ug,重复性才好,这也有可能是我处理的该基因表达少,再就是分光光度计测的不准喽.
至于抹带这个问题,我到现在都没弄明白,有的说是由于酶过量,Mg离子或dNTP过量,循环数多等原因造成的.但我觉得我的实验抹带不是这些原因,因为同样的条件有时有抹带,有时没有.奇怪的是刚反转录出的cDNA做就比较容易扩出单一条带,CDNA用个两三次后,就老是有抹带.不知道是不是cDNA反复冻融降解了,但文献上都说cDNA很稳定.呵呵
还有我也很同意楼上说的作实验一定要尽心尽力,不可一心二用.急噪时最好先停一下明天再做,因为即使作了也是无用功.我可是深有体会,好奇怪,觉得是一样的做,但尽心时就能作出好结果!
祝大家实验顺利!

作者: H2O 时间: 2015-10-9 10:41

pcr 总是没有条带，只有很长的拖尾，怎么办~请教~！

作者: wood533 时间: 2015-10-9 10:41

实验马上要开始了,请问一个问题,取的新鲜组织,是不是一定要用液氮研磨.

作者: taoshengyijiu 时间: 2015-10-9 10:42

QUOTE:

原帖由 wood533 于 2015-10-9 10:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
实验马上要开始了,请问一个问题,取的新鲜组织,是不是一定要用液氮研磨.

用液氮研磨，目的就是低温减少RNA的降解，个人认为，只要条件允许，还是用液氮研磨好点；新鲜组织可以直接加入TRIzol匀浆。
我们实验室一直以来都是用液氮研磨的，感觉提的RNA质量都还可以。

作者: taoshengyijiu 时间: 2015-10-9 10:43

刚开始做实验，说一点小心得。
因为开始找不到液氮罐，所以我用冰盒取组织，取完后组织冻于-80度冰箱，可以提出RNA。提取效果还不错，但目前不知冰盒取组织后多长时间之内放入冰箱？
我按照国外文献作的，引物没有问题，但其中一篇文章的扩增条件有问题，按他的条件根本没有条带，后来自己摸索的。
cDNA确实很稳定，我冻于-20度冰箱反复用好几次，没问题的。

作者: rfv 时间: 2015-10-9 10:44

刚刚开始做PCR，班门弄斧谈点自己的心得和疑惑
我的PCR主要是做基因敲除动物的鉴定，主要针对所敲除的DNA基因片段进行扩增，来判定动物是纯敲除、杂合子抑或是野生型。楼上很多战友谈的都是RT-PCR，相对来说DNA要稳定得多，也不怎么怕污染，我想新手学PCR还是从DNA入手比较合适。实验过程中有些要注意的问题：
1.要注意外部因素的影响，试剂、仪器的改变都可能导致结果不同。我们从分子生物大实验室搬到老板自己的实验室之后几次条带跑的都很淡，经过一番摸索，重新配置了体系，微调了反应温度之后才清晰起来。
2.实验过程中要耐心、仔细。PCR真的是个很玄妙的东西，一些不起眼的小细节都会使实验失败，特别是在同时配制多个样本体系的时候，要在心里数清步骤，不要漏加或者多加；分装的时候装好和未装的ep管要分清；放入PCR仪之前最好在振荡器上震一下，再离心几秒钟，保证没有气泡和附壁；点到胶上的时候每点一个孔就要在电泳槽里洗一下枪头，等等。
3.实验前就要预判体系是否过期，量是否足够，否则后悔都来不及。实验多失败几次，看看条带基本就知道是那个试剂出问题了。我是采取四引物法，其中某一引物过期往往只能跑出两个条带中的一条，而且比较模糊，如果Taq酶出现问题则整个胶都是花的。
最近几次PCR新配了引物，Taq也换了新的，结果都比较满意。最大的疑惑就是在胶的最前端引物二聚体往往非常浓非常亮，有的拖尾比较明显，至今还在思考原因，望高手指点。

作者: ladyhuahua 时间: 2015-10-9 10:44

我做PCR主要是找脂肪酶基因

作者: vera+ 时间: 2015-10-9 10:44

研究生读了快一年了，上课之余也去实验室做点东西，太高深的做不了，主要还是做PCR测序和RFLP 的，从一开始的菜鸟到如今的游刃有余，有一些心得和感受的，在此与大家分享一些。
最重要的是引物的设计。强烈推荐Primer3 (v. 0.4.0)在线设计网址cuturl('http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi')。一开始用Primer5，可能是个人对于引物设计原则贯彻不透彻，每次设计的引物大约有四分之一扩不出的，其中不乏综合分90以上的。后来改用Primer3 在线设计，只改几个参数，几乎是傻瓜式，但是设计的引物都是超好用^_^有一个片段的区域用Primer5折腾了7对引物都扩不好，改用Primer3 (v. 0.4.0)在线设计就一次OK了
反应条件也很重要，每个实验室都有自己的惯用的试剂和配方，从一个实验室到另一个实验室，试剂和机器换了，最好重做一遍梯度。
还有一个细节，个人感觉除了操作仔细小心外，有一点很重哟，千万别随便更换体系。一开始我每次摸条件时做20ul，之后测序的话就做40ul体系，但是发现总是不如摸条件时的条带理想，后来就都做20ul了，宁可多做几管。
都说PCR是很诡异的东西，有时候突然就不出条带了。我也经历过两次，但都是个人失误，一次是误把未稀释的镁离子原液直接加了，导致一个星期跑胶一片空白，还有一次是急着赶时间，溶引物时溶了两管上游引物，当然什么都没有啦。希望大家不要像我这么不小心
总之普通pcr还是很好伺候的试验，只要你够细心^_^

作者: idea2011 时间: 2015-10-9 10:45

请问PCR buffer 本身就有mgcl2,这样子的话还需要另外加镁离子么?我看操作说明书上是没有的,但是我师姐的实验记录里面是有写的

作者: jude 时间: 2015-10-9 10:45

请教：前几次做PCR时都能出来结果，但隔了几个星期后，再做相同的实验，结果什么都没有，为什么呢？

作者: taoshengyijiu 时间: 2015-10-9 10:46

大家都已经发了那么多的经验了．．．．．．．．．．
去年开始做PCR，已经有半年了，从学习PCR到最后全部的上手都是以个人开帖子慢慢摸索的，这其中的味道真是什么都有
第一次扒文献的引物，是篇cancer res上的，觉得肯定没有问题，结果什么也没有出来。。。。第一次发现文献也不可靠，最后自己倒腾下居然结果很好，特异性也强，最重要的是最后做出的结果很漂亮，我们是做分子药理的，证明基因对药物敏感，当看到那张有梯度的图出来的时候别提多兴奋了，感觉一下子high到了极点..........
哈哈，不过最后越做越多就发现这个东西。。。。。。。。。。
不说了，WB的检测也已经过关，眼看自己的毕业就要搞定了，嘻嘻，终于可以毕业了

作者: ero11 时间: 2015-10-9 10:46

我是一个新手，看了各位的经验收益颇多。我是做关于白血病耐药基因的，希望大家给些指点。Blush

作者: vera+ 时间: 2015-10-9 10:47

PCR的引物，似乎没有说的那么悬，只要找到了保守区域，怎么扩都可以出来片段，区别只是扩增效率的问题。
而有时候，保守区域就那么一小段根本没有必要用什么自动寻找引物的各种软件，可以让你移动的位置也就够一个引物的位置。
而保守区域，需要下载全面的序列，然后比对就可以了。
在这个基础上，去看文献的引物，就心里很有数，谁在说真话，说在说谎。
而多重PCR，需要注意的事项会相对多一些。但保守区域无论何时都是根本。

作者: feixi 时间: 2015-10-9 10:47

做了将近两个月pcr，时间不长，但酸甜苦辣，个中滋味，只有自己才能体会，在pcr版潜水了两个多月，学到了很多的东西，下面也简单说说我的一些心得，上面战友提到过的一些我就不多说了，希望能对其他战友有所帮助，有所启发，说得不对的时候，也希望战友拍砖。
1 先说污染问题，对于一般的pcr，个人认为没有那么邪乎，去超净台麻烦，我直接在我的实验台操作，tip头高压灭菌，ep管进口的，直接取用，别说口罩，帽子，手套后来我都未戴，也没有发生污染的事，可能也和周围环境有关
2 操作细节：冰上加酶（一般酶的说明书都有说明原因），且放入pcr仪之前，pcr仪需达到94度（即预变性这步），尽可能提高反应特异性。
3 一般pcr，设55、60、65度退火，一般第一次都能p出，如无则设67度和50度，再无换引物
4 对于重叠pcr，园子里战友一般讨论模板量太高P不出来，我却碰上了量太少而P不出来的情况，当时怎一个郁闷了得，也对具体情况具体分析有了更深的认识；再有就是不同公司的酶确实有差异，我先用takara的rTaq预试验，然后pyrobest突变，在一段基因上突变了两个，但是到第三个点的时候，死活重叠不出来，整整耽搁了两周，当时都快崩溃了，后来我抱着死马也当活马医的想法试了fermentas的pfu，居然扩出了很清晰的目的条带，今天测序结果发回，三个点全部突变成功，所以实在P不出来时可以试着换下试剂
5 关于2次pcr，我和实验室师姐都碰上了胶回收会再P却p不出来的现象（用takara的回收试剂盒），园子里战友分析说是乙醇残留导致的，后来直接取产物2次p，结果还可
6 原来只是听说dNTP反复冻融会变性，真让我一同学碰上了，大半管的dNTP居然不起作用了。。
pcr过程中会碰到很多问题，碰到问题就要troubleshooting，这才是不断学习的过程，都说pcr很难，但只要多一点细心，多一点恒心，多一点耐心，肯定会得到你所需要的结果，借用在园子里看到的一句话与大家共勉：往往当你崩溃的时候，也就是pcr结果出来的时候！我是真正经历过了，你呢？

作者: 3.14 时间: 2015-10-9 10:47

如何预防PCR过程中发生的 “产物”污染？

请各位高手指导！拜托

作者: 65urh 时间: 2015-10-9 10:48

大家能不能告诉我哪里能找到在引物设计软件上如oligo 和 priemer ？？
谢谢了，很想学一下！

作者: zhenxin 时间: 2015-10-9 10:48

看了大家这么多帖子实在是有感而发，本人从去年9月做RT-PCR到现在
整整一年的时间，刚开始没有觉得逆转录这一步很重要，但我的目的基因就是扩不出来，也可以说有时有有时没有，后来在今年的四月份从新设了引物结果三天就搞定了，当时觉得以前那一对引物真是害人啊
做到6月份的时候老板要求我补一个实验结果，所以我又开始做RT-PCR，心里想肯定一次搞定，所以根本有没有太在意，结果，哎，我一直做到现在。6月10号开始提了RNA做逆转录后扩出来很多非特异条带，目的条带也不亮，后来重新逆转录后什么都扩不出来了，这里可能与我的逆转录试剂盒有关，去年9月买的估计过期了，接着做第三次逆转录（用新的逆转录试剂）结果却更是郁闷，那一对让我三天做出结果的引物怎么都扩不出来，而那一对被我认为不稳定的引物却扩出来了，而且很稳定，晕啊！！
由于这次虽然扩出来了但不符合要求，我再次提RNA，这次提RNA试剂都是新的很好的试剂，又买了新的逆转录试剂盒，结果两个引物都没有扩不来（需要说明一下虽然我的两个引物扩不出来，但内参每次还是能扩出来的），到目前我的那个结果仍是没有补出来，曾经怀疑过是PCR试剂或者引物不行了，但我扩四月份提的模板同样的条件却扩出来的很好，这充分说明是我逆转录的模板有问题，哎，但就是不知道哪一环节出问题了。内参有条带，目的基因就是跟我作迷藏！！！

作者: summerxx 时间: 2015-10-9 10:49

我们这里都是用试剂盒，感觉并没有什么太难的。唯一和操作手册不同的地方是，经常用远大于100mg的组织来提RNA。

作者: ns5fan 时间: 2015-10-9 10:49

我从组织中提取DNA,做普通PCR,每次用研磨器研磨组织，请高手指教研磨完组织后，研磨器用清水洗净后，还需要高压消毒吗？谢谢！

作者: finger 时间: 2015-10-9 10:49

关于提RNA，如果样本是 Cell的话，我推荐看上海孤儿在本站发表的技术帖。对于cell，他的方法是完全有效的，我两年前提的RNA，效果和新提的没什么区别，稀释1000倍仍有目的条带。
在这里想和同行们探讨一下，PCR稳定剂和增强剂的作用。
我使用过DMSO，BSA，Betaine，现在正在研究甘油和甲酰胺。
在我的体系中2％的DMSO最optimize，BSA则是万金油，Betaine作用更大是在体系的稳定性上。
想抛砖引玉，除了这些，还有什么物质有效，听说我们实验室97年前酶都是自己表达的，我有兴趣做做基础研究

作者: 西子 时间: 2015-10-9 10:50

刚开始做RT-PCR，没有成功过，后来实验需要做普通PCR，第一次把PCR结果扫描进电脑后，心情别提有多高兴了，后来再去做RT-PCR也是全面成功。
我觉得PCR是分子生物学的基本功，好像美国中学生在校园里做PCR的，三个水浴锅，计时器，提来提去，然后去跑电泳。
PCR成功的基本条件：
第一：模板要好，DNA或RNA一定要提的好！
第二：引物最好不直接采用文献报道的（我用的引物都是文献上的，运气比较好，都能做出来），自己去设计，或者把文献上的引物和DNA序列或CDNA 序列进行比对，能对上再继续做。
第三：会跑电泳，不能图省事。我个人多用5%聚丙烯酰胺凝胶，然后EB染色，危险是多些，但效果比较好，用琼脂糖要注意胶的厚薄浓度，电泳液配胶等等。
还有就是做的时候，根据实验要求，可以适当使用不同档次的TAQ酶，省钱的同时不会影响结果，记住国外进口分装的酶和完全进口的是两个概念，PCR贵的就是酶
减小反应体系，批量进行实验是省酶的法宝，这样多多尝试，PCR就尽在掌握之下了。

作者: vcve 时间: 2015-10-9 10:50

刚开始做RT-PCR，虽然前面的一帆风顺，可是最近却又受挫连连，小结一下，防其他战友走老的弯路!
1 正如上面师兄们所说的RNA的提取十分重要，这是基础，后面的一切均是在这个基础上累计出来的。
2 注意所用的的东西如EP管、tip头等等一定要用DEPC水（0.1%）泡至少一天，然后在高压灭菌锅中消毒灭菌。之后就是在烘箱中烤干，一般两天后再用最好。
3 操作时要带上橡胶手套，时刻提防RNA的降解。最好戴上口罩，要不就少说话。
4 所加体系可以少一点，我们实验室一般是RT20ul体系，PCR25ul体系。所用到的试剂也相应减半。
5 体系中的各个试剂的量是有一定的规律的，任何一种都不能过多或过少，对于摸索阶段可以尝试几个梯度来做，主要就是dNTP、Mg离子浓度。有时候我们也尝试改变所用的Buffer来进行PCR。例如用buffer viii，即是5*buffer，效果会好一点。
6 跑胶一般用90V即可，时间可以伸缩。胶的浓度要看所检验的东西，一般RNA是用1%、DNA用2.5%
7 一定要用心，实验是需要有感情投入的！

作者: ero11 时间: 2015-10-9 10:57

CDNA还要测浓度吗？
我做RT-PCR时有时无，测序结果确实是目的产物就是很不稳定，都半个多月了，还未解决，很头大，我现在怀疑是我的反转录产物的问题，但是不知道该怎么验证，我是用特异性引物反转录的。

作者: finger 时间: 2015-10-9 10:59

提RNA那是相当的重要啊，这几次做rt-pcr时都遇到基因组污染了

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