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标题: 【求助】电泳配胶的问题 [打印本页]

作者: JK.jon 时间: 2015-10-9 11:08 标题: 【求助】电泳配胶的问题

请教各位老师，如何配胶才能使胶孔最好呢？看看我配的胶，总是歪歪扭扭的，跑出的条带更是歪歪扭扭，放在微波炉里溶胶最好是多长时间呢？还有就是等到什么时候拔梳子是最佳时间呢？

作者: JK.jon 时间: 2015-10-9 11:09

各位看看我配的胶结果是这个样子的：

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=37810

作者: qhyu 时间: 2015-10-9 11:09

跑电泳的时候注意以下几点：
1、胶的浓度不要太小。如果浓度比较小，倒胶的时候可以倒厚点。
2、溶胶要充分。具体时间不好说，我一般是等胶透明后就取出（这时候还有许多透明的颗粒），然后多摇一摇，直到看不到颗粒为止（特别要注意，透明的颗粒也不能有）。配好的胶再溶的时候也应充分，一般2、3分钟吧（得看情况来定，胶多就多溶一会儿，胶少就少溶一会儿），也得多摇一摇，使所有的团块都融化。
3、倒胶前应先洗掉梳子上残留的胶；倒胶的时候要一气呵成。
4、要等胶充分凝固后才能拔梳子（我一般至少要等40分钟左右）。拔梳子的时候要轻柔，不能太快。
5、加样的时候，最好不要把Tip头伸进上样孔中（当然，如果上样孔比较大，伸进上样孔也行，但最好不要接触上样孔四周的胶），因为这样很容易使上样孔变形。应该将Tip头伸到液面下、上样孔正上方、几乎接近上样孔，缓慢上样，让样品自己沉降到上样孔中。
一点愚见，不一定正确。

作者: JK.jon 时间: 2015-10-9 11:11

我一般都是1.5%,2%的胶，100ml，每次从微波炉里拿出来都是一摇就好多起泡，也看不到什么透明颗粒啊，一般我都煮到不再沸腾后，大概3分半钟，是不是太久了？

作者: yizhi 时间: 2015-10-9 11:11

只要不喷出来，胶烧得稍久点没有什么影响的！
时间太久也只是要考虑水分蒸发的问题！
拿出来你先摇，然后冷却，泡消失后再倒胶，倒胶的时候有气泡对你的结果影响可就大了！
有的条带还可以，其他的是不是可以考虑一下上样量太多了！
marker是歪的，是不是胶不均匀！
即供参考！

作者: zbs 时间: 2015-10-9 11:11

制胶还是要经验丰富才行。
从我做胶的过程来看，我觉得有一下几点可供参考：
1、用微波炉加热不能冒泡太厉害，一般是看到它在开始冒泡的时候就可以先关掉，取出烧杯看琼脂糖是否已全部熔化，标准是看液体是否均一，如果不行再加热一次。两次绝对就可以了。
2、到胶若出现气泡应想办法去掉，带气泡跑电泳十绝对不行的，在边上没太大问题。有气泡的话可以用移液枪把它吸掉。
3、电压宜低不宜高，一般5V/cm。

作者: ujne 时间: 2015-10-9 11:12

应该是混胶不匀的问题。

作者: HP007 时间: 2015-10-9 11:14

您的意思是混胶不匀，那具体做的时候应该怎么注意才能避免呢？谢谢你

作者: bojitu 时间: 2015-10-9 11:14

把胶配好后放在微波炉里烧开一看见冒泡就关掉微波炉（一定要自己在那儿盯着，呵呵），然后再打开，反复几次仔细看一下胶和瓶子上面的附着的颗粒很透明熔化就可以了。

作者: gogo 时间: 2015-10-9 11:14

点完样后不要马上跑，静置几分钟。

作者: eor 时间: 2015-10-9 11:16

MARK很歪，并且看了你的点样孔也插歪了，可能是这个原因。另外，你在制作点样孔时，或在加样时，是否把孔撞成虫蚀状了？

作者: eor 时间: 2015-10-9 11:17

MARK很歪，并且看了你的点样孔也插歪了，可能是这个原因。另外，你在制作点样孔时，或在拔出梳子时，或在加样时，是否把孔撞成虫蚀状了？一般的胶不会这么脆弱的，有可能你的胶浓度不够或质量不好造成的。

作者: JK.jon 时间: 2015-10-9 11:18

谢谢各位老师，现在胶好多了，可能是我配好胶放的时间太短了，所以梳子拿出来后孔都变样了，不过我们实验室的梳子真的是不好用阿。还想请问一下，加样后不是要立即跑吗？要静置几分钟没有影响吗？谢谢

作者: zhenxin 时间: 2015-10-9 11:18

建议用宽的梳子，尤其是在做论文pic时，仅是看看试验结果可选用窄的.....毕竟剩胶........再有就是4℃放一段时间后，拔的效果可能会好点.....
加样后一定要立即跑啦，不然的话全扩散了呀.......

作者: wawa 时间: 2015-10-9 11:18

我在制胶的时候很注意以下几个问题,结果还算满意:
1.首先你的琼脂糖质量要好,我们用的西班牙的.
2.我一般煮胶煮两次,第一次看到冒泡就赶紧关掉微波炉(中火,1-2min),取出震荡均匀(记得戴手套哦),再次加热,重复前面的过程.
3.等胶充分凝固的时候,轻轻拔梳子,两手用力要均匀,不要反复晃动梳子!
4.点样时,枪头不要伸到胶孔的底部,否则很容易弄破胶.
此外,还要注意电泳的时间,尤其是Pcr产物,宁愿少跑!
以上是自己的心得,希望对你有帮助,一起奋斗哦!祝你好运!

作者: loli 时间: 2015-10-9 11:18

我想配好胶放到四度一段时间再拔梳子可能会好点，我会试试，我用的是生工的琼脂糖，每次煮胶都要看着，一冒泡就要关掉微波炉，然后再打开，一直持续到它不怎么再沸腾的时候才行，不知道这样对不对。

作者: moonlight 时间: 2015-10-9 11:19

我们用的胶0.8-1.4从来没有拔坏过梳子的,我想你可以买点小包装的西班牙的产品(30元左右10g)品,或许会有改善的!

作者: redbutterfly 时间: 2015-10-9 11:22

我看你的电泳图很像是胶太凉造成的。我的经验是在胶略烫手时倒。其他注意事项各位站友说得都挺全。还有一点，最好用500ml的锥形瓶配胶，微波炉刚好够高，还且口小，加热时可找个小塑料袋子罩在上面，减少蒸发。

作者: kuaizige 时间: 2015-10-9 11:22

我也遇到同样的问题了，后来发现是孔洞的问题，在拔梳子的时候一定要确定胶已经完全凝住了，拔梳子是要有一定阻力的。此外现配现用的胶最保险，胶放过以后，或者反复碰过，内部会有断裂，尤其是孔洞处，孔洞不规则，条带也就不好看。

作者: nn255 时间: 2015-10-9 11:23

我一般都是1.5%,2%的胶，100ml，每次从微波炉里拿出来都是一摇就好多起泡，也看不到什么透明颗粒啊，一般我都煮到不再沸腾后，大概3分半钟，是不是太久了？

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怎么用那么浓的胶？
煮一煮，摇一摇^_^在煮一煮~

作者: yayya 时间: 2015-10-9 11:24

以上大家都说了很多好的方法,我在补充点个人意见,可做参考,
1拔梳子前备一吸管,从电泳槽中吸缓冲液沿梳子两侧冲一下,液体流回电泳槽,然后缓慢拔出梳子
2梳子固定牢稳,可靠个支撑物防止灌胶时梳子歪倒
3一般100ml2-3分钟,50ml1-2分钟,最好看着防沸腾喷出
4胶不要太凉,用纸拿着不烫手时应该就可以灌
5从一角缓慢灌入,扶住梳子
以上几点小建议,结合以上各位的高见,可以拔出光滑的孔,得到一块完美胶!
嘿嘿

作者: memory 时间: 2015-10-9 11:24

点完样不要马上跑,要静置几分钟,为什么啊?这样,样品不就扩散了吗?

作者: koook5695 时间: 2015-10-9 11:29

上完样后放置一到两分钟比较好，也不会扩散那么快拉。
放置一会的好处是让样品都沉到底部，跑出来的胶会整齐一些，当然好看拉。

作者: ns5fan 时间: 2015-10-9 11:29

需要放那么久吗?不会扩散吗?一个25孔的胶从头上到尾前面已经扩散了,再说加了上样缓冲液就可以把DNA沉淀的很好了呀?

作者: guagua 时间: 2015-10-9 11:30

跑电泳的时候注意以下几点：
1、胶的浓度不要太小。如果浓度比较小，倒胶的时候可以倒厚点。
2、溶胶要充分。具体时间不好说，我一般是等胶透明后就取出（这时候还有许多透明的颗粒），然后多摇一摇，直到看不到颗粒为止（特别要注意，透明的颗粒也不能有）。配好的胶再溶的时候也应充分，一般2、3分钟吧（得看情况来定，胶多就多溶一会儿，胶少就少溶一会儿），也得多摇一摇，使所有的团块都融化。
3、倒胶前应先洗掉梳子上残留的胶；倒胶的时候要一气呵成。
4、要等胶充分凝固后才能拔梳子（我一般至少要等40分钟左右）。拔梳子的时候要轻柔，不能太快。
5、加样的时候，最好不要把Tip头伸进上样孔中（当然，如果上样孔比较大，伸进上样孔也行，但最好不要接触上样孔四周的胶），因为这样很容易使上样孔变形。应该将Tip头伸到液面下、上样孔正上方、几乎接近上样孔，缓慢上样，让样品自己沉降到上样孔中。
一点愚见，不一定正确。
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SDS-PAGE电泳跑的图都花了，条带也歪了，MARKER也歪了。胶凝的挺好的，不知道什么原因，大概是什么原因啊？希望各位大神给予帮助~~

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