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标题: 【求助】为什么我只有溶解曲线，而没有扩增曲线？ [打印本页]

作者: fox_79 时间: 2015-10-9 16:51 标题: 【求助】为什么我只有溶解曲线，而没有扩增曲线？

刚开始做Real time PCR，做了几次，每次都是只有溶解曲线，而没有扩增曲线？大家能告诉我原因吗？

作者: woshi 时间: 2015-10-9 16:52

相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征
你是不是在扩增的时候没有读板？把你的反应程序传上来看一下呢，我们实验室反应程序基本上如下：
94 c 3min
94 c 30sec
60 c 30sec
72 c 45sec
78 c 1sec
read plate
Goto line 2 for 39 more times
72 c 10min
Melting curve from 65 to 98 ,every 1.0 C,hold 1 sec ,read plate
72 c 5min
我们基本上都是这样做的，还没有遇到过你说的这种情况。

作者: seagate 时间: 2015-10-9 16:52

95c 5mim
95c 15s
60c 60s
read plate
Goto line 2 for 40 more times
95c 60s
55c 30s
read plate
95c 30s

作者: pore 时间: 2015-10-9 16:52

我觉得你没有得到扩增曲线可能是跟你的反应程序有关，你的反应程序只有变性和退火两步，没有延伸，产物都没有扩增，荧光信号当然不会增加了．为什么你溶解曲线分析的时候，只做了两个温度呢？做两个温度的溶解曲线是什么样？你能不能把你溶解曲线传上来看一下呢？建议你按我上面的反应程序做一下，祝你好运！

作者: xiaoxiaoniao 时间: 2015-10-9 16:52

反应程序,我的退火和延伸在同一步里,当目的基因的片段在150 bp以下的时候是可以将退火和延伸合为一步的,我先做一般PCR,跑胶的时候跑出来的.这一步应该没什么问题的.做溶解曲线的时候我是按电脑默认的程序做的,因为我对溶解曲线的设定不熟悉.但是还是可以看得到溶解曲线,所以我认为溶解曲线是做出来了的.

作者: fox_79 时间: 2015-10-9 16:53

cuturl('http://pickup.mofile.com/0461953493565402')
请在这里提取

[ 本帖最后由 fox_79 于 2015-10-9 16:54 编辑 ]

作者: xiaoxiaoniao 时间: 2015-10-9 16:54

从你的溶解曲线来看，应该说你的ＰＣＲ没什么问题，而且产物比较单一。不知道你用的哪家公司的定量ＰＣＲ仪，因为不同仪器反应程序的设置可能不一样，建议你把仪器的操作手册再仔细研究一下。或者把你所用的仪器型号说一下，或许有其他战友用过相同的仪器，这样就能更有针对性的帮你。

作者: fox_79 时间: 2015-10-9 16:55

我用的是Mx3000p.

作者: 65urh 时间: 2015-10-9 16:55

我正在做Q-PCR,用染料的方法,使用的是ABI7300,但是,40个循环跑完之后,要进行溶解曲线分析,但这个仪器我不会用.哪位战友能告诉我具体的做溶解曲线的步骤,先谢了

作者: fox_79 时间: 2015-10-9 16:56

今天去和实验室里负责Real time PCR的老师请教了下,我仪器的程序设置是没有问题的.她也说自己从来没有遇到过这种情况.但和她的交流中,我似乎发觉了原因的所在,明天再做一次试下.如果是那个原因的话,将和大家一起分享我的经验教训.

作者: qhyu 时间: 2015-10-9 16:56

我正在做Q-PCR,用染料的方法,使用的是ABI7300,但是,40个循环跑完之后,要进行溶解曲线分析,但这个仪器我不会用.哪位战友能告诉我具体的做溶解曲线的步骤,先谢了

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我的实验室也是ABI7300，但还没有开始做。不知你有没有完整的作业知道书。

作者: qhyu 时间: 2015-10-9 16:56

你是不是在扩增的时候没有读板？把你的反应程序传上来看一下呢，我们实验室反应程序基本上如下：
94 c 3min
94 c 30sec
60 c 30sec
72 c 45sec
78 c 1sec
read plate
Goto line 2 for 39 more times
72 c 10min
Melting curve from 65 to 98 ,every 1.0 C,hold 1 sec ,read plate
72 c 5min
我们基本上都是这样做的，还没有遇到过你说的这种情况。
......

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你好，我一看你的帖子就知道你是高手，我有一个问题，我做的病毒类的real-time PCR，这个时间、温度设定可否和你的一样？谢谢了

作者: bojitu 时间: 2015-10-9 16:57

我觉的有溶解曲线就应该用扩增曲线，除非溶解曲线为引物二聚体的，（但你的常规PCR跑胶没问题），我用ABI 7300做的

作者: bojitu 时间: 2015-10-9 16:57

你的扩增曲线，溶解曲线都有，其他问题指的是什？结果分析？分析结果还的把PCR结果导入分析模块中进行（ABI 7300）

作者: rfv 时间: 2015-10-9 16:58

PCR 的退火温度，我觉得你还是要做一个温度梯度PCR，然后跑胶，在紫外光下观察，那个温度下P出来的条带最亮，从而找出你的引物的最佳退火温度。至于变性，退火，延伸时间，这要根据你扩增的目的片段的大小来决定。一般来说，Taq酶的扩增速度是1000bp/s，所以你可以根据你的产物大小来决定你反应的时间。

作者: fox_79 时间: 2015-10-9 16:58

你的扩增曲线，溶解曲线都有，其他问题指的是什？结果分析？分析结果还的把PCR结果导入分析模块中进行（ABI 7300）

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我的基线和域值呢?
另外我的其他结果是没有的.
就只有这这2张图的结果.

作者: summerxx 时间: 2015-10-9 16:59

QUOTE:

原帖由 fox_79 于 2015-10-9 16:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你的扩增曲线，溶解曲线都有，其他问题指的是什？结果分析？分析结果还的把PCR结果导入分析模块中进行（ABI 7300）

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我的基线和域值呢?
另外我的其他结果是没有的.
就只有这这2张图的结果. ...

在Fluorescence栏下选择dRn项（不选R），然后Threshold fluorescence下就出现阈值，阈值线也会出现。
因为你做的样本是未知类型，所以不会有标准曲线，只会有扩增曲线和融解曲线。

作者: ending 时间: 2015-10-9 16:59

你下载附件后解压，2张图可以直接打开，1个文件用SDS软件打开，可以看到条件设置，并可以数据分析

作者: ns5fan 时间: 2015-10-9 16:59

我觉得原因是你的模板量太高,PCR扩增没有使荧光量相对背景荧光而言没有得到增加,而你的溶解曲线是你的模板的溶解曲线.
稀释模板应该能够解决这个问题.

作者: TNT 时间: 2015-10-9 17:00

你下载附件后解压，2张图可以直接打开，1个文件用SDS软件打开，可以看到条件设置，并可以数据分析（上面发错了，忘了+附件）
请帮忙看看我的数据,没有基线,怎么感觉曲线那么不好呢?
还有要做溶解曲线,操作步骤是什么?

作者: fox_79 时间: 2015-10-9 17:00

QUOTE:

原帖由 TNT 于 2015-10-9 17:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你下载附件后解压，2张图可以直接打开，1个文件用SDS软件打开，可以看到条件设置，并可以数据分析（上面发错了，忘了+附件）
请帮忙看看我的数据,没有基线,怎么感觉曲线那么不好呢?
还有要做溶解曲线,操作步骤是什么? ...

首先对你的帮助表示感谢，但我用的仪器和你不同，所以你的图对我的帮助不大。

作者: SO2 时间: 2015-10-9 17:01

能把你的实验原文件发上来吗，我用软件打开再分析下，单从这几张图上开不出问题在哪儿。

作者: fox_79 时间: 2015-10-9 17:02

QUOTE:

原帖由 SO2 于 2015-10-9 17:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
能把你的实验原文件发上来吗，我用软件打开再分析下，单从这几张图上开不出问题在哪儿。

主要问题我现在已经解决了,只要将reference dye改为none 就可以了.
但现在还有个疑问,就是我第一次做的按这样改还是只有溶解曲线,而扩增曲线在fluorescence下选择dRn和Rn是都没有结果的,当然text report也是没有结果的.

作者: fox_79 时间: 2015-10-9 17:02

补充一下,第一排是一个基因,第二排是另外一个.第二排的溶解曲线做的还行,你就先看第二排的结果吧.

作者: 了了 时间: 2015-10-9 17:03

楼主已经做出曲线来了，似乎只是结果分析问题了，建议把仪器说明书翻一翻，或者找同实验室会用那个仪器的人，很快就能得到需要的答案．

作者: fox_79 时间: 2015-10-9 17:03

我的第一排的溶解曲线不是很理想,是更换引物好,还是优化条件,或者用其他什么方法解决 ?

作者: 65urh 时间: 2015-10-9 17:03

QUOTE:

原帖由 fox_79 于 2015-10-9 17:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我的第一排的溶解曲线不是很理想,是更换引物好,还是优化条件,或者用其他什么方法解决 ?

从溶解曲线上看，似乎没有引物二聚体的影响，主要还是非特异性扩增，而且Tm值跟目标扩增产物的Tm值较接近，这样看来，优化条件改善结果的可能性不大，个人建议还是从引物上解决问题。

作者: 65urh 时间: 2015-10-9 17:04

补充一点：
分析时有R,Rn,dR,dRn，分别是原始荧光信号、归一化的荧光信号、消除背景的荧光信号和归一化的消除背景的荧光信号，个人认为使用dR和dRn均可。

作者: fox_79 时间: 2015-10-9 17:05

QUOTE:

原帖由 65urh 于 2015-10-9 17:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

补充一点：
分析时有R,Rn,dR,dRn，分别是原始荧光信号、归一化的荧光信号、消除背景的荧光信号和归一化的消除背景的荧光信号，个人认为使用dR和dRn均可。 ...

我一直也很困惑这4者之间的意义及区别，谢谢！

作者: c86v 时间: 2015-10-9 17:05

求教，real time PCR跑不出曲线，却有CT值，求教啊

作者: lorri 时间: 2015-10-9 17:05

我昨天也遇到了这种情况，没有扩增曲线，但是有溶解曲线。今天仔细跟之前做的比对了下，发现是不小心将采集荧光的图标点灰了

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