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标题: 【转帖】一种快速，灵敏的，经济的测序方法--焦磷酸测序 [打印本页]

作者: PCR 时间: 2015-10-10 10:05 标题: 【转帖】一种快速，灵敏的，经济的测序方法--焦磷酸测序

NA序列分析技术是现代生命科学研究的核心技术之一，而双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法)是目前使用最普遍的DNA序列分析技术。在基于Sanger法的全自动DNA测序技术中，测序反应产生的DNA片段是荧光标记的，这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离，荧光分子被激发而发光，发出的光信号被检测系统检测。Sanger法的优势在于可以分析未知DNA的序列，且单向反应的读序能力较长，目前的技术可以达到1000bp以上。
在实际工作中，很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证，而这种分析往往测几十bp就可以满足需要.在这种情况下，Sanger法未必是最合适的ＤＮＡ序列分析技术。新发展的Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术应该是目前最适合这些应用的ＤＮＡ序列分析技术。
Pyrosequencing技术是新一代DNA序列分析技术，该技术对DNA的序列分析无须进行电泳，DNA片段无须荧光标记，因此相应的仪器系统无须荧光分子的激发和检测装置.本文将就Pyrosequencing技术的原理和应用进行介绍和讨论．
一、Pyrosequencing技术的原理
首先通过PCR制备待测序的DNA模板，PCR的引物之一是用生物素标记的。PCR产物和偶连avidin的Sepharose微珠孵育，DNA双链经碱变性分开；纯化得到含生物素标记引物的待测序单链，并和测序引物结合成杂交体。
Pyrosequencing技术是由四种酶催化的同一反应体系中的酶级连反应，四种酶是：DNA聚合酶（DNA polymerase）、硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase).反应底物为adenosine 5′ phosphosulfate (APS)、荧光素(luciferin)。反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。反应体系配置好后就可以加入底物dNTP进行序列分析了。
测序反应是这样进行的：在每一轮测序反应中，只能加入四种dNTP（dATP S，dTTP，dCTP，dGTP）之一，如该dNTP与模扳配对，聚合酶就可以催化该dNTP掺入到引物链中并释放焦磷酸基团（PPi）。掺入的dNTP和释放的焦磷酸是等摩尔数目的.注意：反应时deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATP S)是dATP的替代物，因为DNA聚合酶对dATP S的催化效率比对dATP的催化效率高，且dATP S不是荧光素酶的底物。
硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，ATP和焦磷酸的摩尔数目是一致的。ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素(oxyluciferin)的转化，氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。光信号由CCD摄像机检测并由pyrogram™反应为峰。每个峰的高度(光信号)与反应中掺入的核苷酸数目成正比。ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。然后就可以加入下一种dNTP。过程见图1 Pyrosequencing技术的原理：随着以上过程的循环进行，互补DNA链合成，DNA序列由Pyrogram的信号峰确定。
商品化的Pyrosequncing试剂盒通过以下几点来保证反应的有效进行:底物浓度已最佳化，高质量的三磷酸腺苷双磷酸酶保证了所有的dNTP被降解，包括ATP和dATPαS；dNTP降解速率慢于掺入速率，有利于dNTP充分掺入；ATP合成速率快于ATP水解速率，使的ATP浓度和光产生正比于掺入的dNTP数目。
有必要指出的是Tongueyrosequencing技术可以确定一个模板的20-30bp的序列。有的研究者经过改进而使该技术的读序长度增加一倍以上[1]。
为了增加信噪比，在Pyrosequencing技术中，用dATPαS取代dATP，因为dATPαS可以比dATP被DNA聚合酶更有效利用，也更有利于阅读富含T的区域，且dATPαS不是荧光素酶的底物。但dATPαS是两种异构体SpdATPαS和RpdATPαS的混合物，聚合酶只能利用SpdATPαS。因此，为了得到最佳反应效率，必需使反应体系中保持最佳浓度的SpdATPαS，但同时增加了相应浓度的无用的RpdATPαS。dATPαS被双磷酸酶降解后的产物是双磷酸酶的抑制剂，所以随着反应进行，被双磷酸酶降解的dATPαS的降解产物浓度越来越大，双磷酸酶的活性越来越低。这可能是Pyrosequencing技术测序长度很短（20-30bp）的主要原因之一。新的革新就在于在反应体系中只加入SpdATPαS，这样一来可以大大降低dATPαS降解产物的浓度，维持双磷酸酶较长时间的活性。目前这个革新可以使Pyrosequencing技术的测序长度增加最少一倍，达到50至上百bp。

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作者: PCR 时间: 2015-10-10 10:06

二， Pyrosequencing技术在DNA测序和SNP研究中的应用:
Pyrosequencing是新一代DNA序列分析技术，因此该技术的第一个应用是DNA序列分析，基于该技术的分析系统配合相应软件还可以进行基于DNA序列分析的已知SNP的分析和SNP频率确定。
Pyrosequencing技术对DNA片段的序列分析的读序长度有限，但这并不影响其在生命科学研究中的价值.我们知道，在很多场合中，我们对DNA序列分析的要求是读序越长越好，比如诸如人类基因组计划的工作，而在很多场合中，读序长度并不是主要指标，读序精确和能说明问题是主要指标，比如分子临床诊断领域，对细菌和其他病原微生物的分子诊断，只需对最能代表该微生物的DNA片段进行分析即可，最能代表该微生物的DNA片段往往也就十几到几十bp。可以提供序列资料的分子诊断是分子诊断的黄金标准，其权威性比其他DNA分析方法如NORTHERN，基因芯片和定量RT-PCR技术更好。
SNP研究大致分为两个部分，一是SNP数据库的建立，二是SNP功能的研究。一种生物的所有SNP的数据库的建立是一件很大的工程，可以承担该工作的是那些具有大规模基因组测序能力的研究单位，而且数据库的建立很大程度上依赖Sanger法测序。但众所周知，如果不研究每个SNP的功能，数据库的建立即SNP的发现就没有多大意义。对已发现的SNP的功能的研究，有两个工作是必须的，一是SNP频率分析，一是SNP位点的碱基种类的证实.对于前者，Pyrosequencing是这样进行的:假设研究者手中有若干份来自不同个体的基因组DNA样品，要测这些不同样品的同一SNP的频率，那么研究者可以混合这些样本的基因组DNA，然后做一次PCR，进行一次测序，研究者就可以得到该SNP在这些样本中的频率.如果研究者已经有了各个样本的PCR产物，也可以将PCR产物混合后进行一次PYRO，就可以知道该SNP频率.已有的文献已经做过高达1126样本的PCR产物的混合来确定SNP的频率[2]。这种做法极大地减少了研究者的实验次数和实验消耗。一些其他研究也利用Pyrosequencing技术来确定SNP频率[3，4]。如果是SNP位点的碱基种类的证实，需要首先得到特定SNP所在DNA片段，即PCR产物，然后在SNP位点的上游和/或下游设计测序引物，这样通过对十几个bp序列测定来确定SNP位点的碱基种类及SNP位点上下游十几个碱基的序列.诸如四倍体马铃薯的一些SNP分析[5]和用于法医研究的线粒体DNA SNP分析[6]也是利用Pyrosequencing技术进行的。
注：转自生物通--黄文晋博士

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作者: PCR 时间: 2015-10-10 10:06

最早开发出这一技术并将该技术商业化的是biotage 公司我们现在采用的就是他们的仪器，给大家介绍一下它的有点（我可不是要卖这个仪器啊）
焦磷酸测序测序仪
系统用途：
多用途遗传分析系统，可应用于各种遗传多态性标记的分析检测，如SNP、突变、插入/缺失、甲基化、基因拷贝数等；等位频率分析；此外，还可应用于各种微生物的鉴定、分型、耐药性评估，并可对多种亚型或野生株及突变株、耐药株组成的复杂群体中的各个组分含量直接加以定量评估；
1.工作环境
1.1 环境温度：18- 28 °C
1.2 相对湿度：30 %-90 %
1.3 适用电源：220V，50Hz，最大功率280W
2.技术指标
2.1 系统功能指标
2.1.1 多用途：可进行SNP分析，突变检测，缺失和插入分析，CpG岛甲基化分析,细菌、病毒鉴定和分型，耐药性分析等，并且有多篇高水平论文支持。
2.1.2 * 采用DNA测序的原理来进行SNP分析，在得到SNP基因型的同时，还可得到多态性位点上下游的序列信息作为参照。
2.1.3 * 通过实时测序的原理得到DNA序列信息，不需要任何电泳或荧光标记。
2.1.4多重分析功能：可以将三个不同的SNP位点放入一个样品孔中进行检测，降低实验成本，进一步提高通量。
2.1.5 *只需一次反应，就可以给出分析2、3和4等位基因SNP的分析结果。
2.1.6 * 等位基因频率分析：可以使用Pooling策略，在一次反应中混合成百，甚至上千份DNA样本，进行等位基因频率分析，加快实验进程，降低成本，频率分析可检出低至5％的频率。
2.1.7 * 检测速度：十分钟左右完成96个样本SNP分析。
2.1.8 通量灵活，易于调节：每次可以选择运行1－96个样本，每个样本可进行不同的SNP位点分析。
2.1.9准确性和重复性：准确性99.95％以上，重复性几乎为100％。

附带上面文章的一章图片

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作者: hyuu 时间: 2015-10-10 10:06

前处理麻烦，配套试剂一点也不便宜，不过特定用途还是蛮适合的
每个技术都有自身局限性，不要完全听信宣传资料

作者: leifengta 时间: 2015-10-10 10:07

楼主，来几篇这个机器做的文献好不？

作者: H2O 时间: 2015-10-10 10:10

你可真搞笑
ng那篇文章谁做的
恐怕不是这个方法吧
你认识gaoyang?,这篇文章的
的分型应该使用sequenom做的

作者: hyuu 时间: 2015-10-10 10:10

pyro最适合的应该是以下几个应用:
环境生物学
宏基因组
病原微生物耐药突变
宏基因组和环境生物学里比如只测16s rRNA的高变区域,pyro会给出有哪些不同16s rRNA序列及各自的精确比例,这样可以得到特定微生物所占的具体比例;有时侯也可以测某些/个功能基因(比如重金属富集或某种污染物降解相关基因)
病原菌耐用基因突变或病毒突变应该也是类似的.
是否还有其他领域不太记得,印象最深的就是这几个,如有其他领域也离不开确定序列的突变与精确比例关系pyro技术的最大特色

作者: PCR 时间: 2015-10-10 10:11

QUOTE:

原帖由 H2O 于 2015-10-10 10:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你可真搞笑
ng那篇文章谁做的
恐怕不是这个方法吧
你认识gaoyang?,这篇文章的
的分型应该使用sequenom做的

首先，非常抱歉将文章发错！
其次，不知H2O 是否很有幽默感，觉得发现他人有一失误就觉得真搞笑？！
最后，知错即改，删除发出的文章。

作者: PCR 时间: 2015-10-10 10:11

不知你说的前处理麻烦是指哪一点。我觉得相对其他测序技术这一方法对样品的前处理还是很简单的，只是设计一对生物素标记的引物做一个PCR，然后就可以用测序引物进行测序了，仅此而已。
我自己就在做，而且是大量的在做。觉得还是很好的。当然，这一技术对于测大片段是无能为力的，但是在特定的方面如检测已知的snp位点、基因分型、突变、插入/缺失、甲基化、基因拷贝数等；等位频率分析;各种微生物的鉴定、分型、耐药性评估，对多种亚型或野生株及突变株、耐药株组成的复杂群体中的各个组分含量直接加以定量评估
等还是很好用的，直接、快速、方便。我的评价！

作者: hyuu 时间: 2015-10-10 10:17

roche的454高通量测序也是用焦磷酸测序的,听说是买pyro的专利,不过很奇怪454现在读长已经从不500bp,听国外的朋友说正在往1kb挺进
所以很奇怪为什么pyro自己的焦磷酸测序还只是100bp>???

作者: hyuu 时间: 2015-10-10 10:19

上pyro的样品还是要求单链么?那就麻烦嘛
焦磷酸测序没有便宜的耗材,如果便宜那是是不是稀释着用了啊 ?但如果稀释的话对样品前处理的要求肯定要更高了啊?
另外大量做或者做服务pyro可能有点优势,自己实验室买了用得上的地方太少,snp目前可选择的方案太多

作者: hyuu 时间: 2015-10-10 10:32

如检测已知的snp位点、基因分型、突变、插入/缺失等；等位频率分析
这几个用途你知道其它其他可选方案么?前面说到的sequenom在这几个地方真正操作起来还是更方便一些吧
pyro的snp等位频率分析听听可以,操作性成问题吧,怎么保证上样量均一,至少医学snp这块我没明白过;当然其他还有什么等位频率分析我不知道那另外再说.

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不过ultravbio 提到的其他用途确实适合,我前面有个贴子漏了说一个肿瘤的甲基化频率分析,这个pyro也是首选.

作者: ha111 时间: 2015-10-10 10:33

楼上还是比较朴实的
snp分型有很多方法
各自都有优缺点，还是根据具体的实验
方案来选择吧
作为一个厂商的就诚实点，不要
说你的技术就是完美的，骗新人有意思吗

作者: hyuu 时间: 2015-10-10 10:34

QUOTE:

原帖由 ha111 于 2015-10-10 10:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼上还是比较朴实的
snp分型有很多方法
各自都有优缺点，还是根据具体的实验
方案来选择吧
作为一个厂商的就诚实点，不要
说你的技术就是完美的，骗新人有意思吗 ...

被人用朴实来形容，汗！
如果是销售可以理解，公司一般就是这样给销售团队培训灌输的啦；生物技术本来就不简单喽，对销售不能要求太高；作为用户偏听偏信受骗上当那是自己活该，总不能白读书不是；
如果是技术支持，就有点遗憾啦，虽然没有哪个人毕业后什么都懂，不过不管什么学历，干几个月对自己产品性能特色的了解还是和刚进公司一样，那也太nb了点；不过现在这样的技术支持也不少见，专业水平高的销售这年头更是难得一见了；比如定量PCR这块原来abi的陈云地走了后就没几个好的了。

作者: hyuu 时间: 2015-10-10 10:34

SOLEXA 听说卖的不错啊，应该不错啊，不过用不到那冬冬，不了解的说

作者: standbyme 时间: 2015-10-10 10:35

能介绍一下这个仪器的发展历史吗？

作者: viviwang1987 时间: 2015-10-10 10:36

请问如果用焦磷酸测序方法测P53基因中的一段特定序列（20多个bp）有无发生点突变，可以用此方法不？如果可以，大概分那几个步骤：抽血提DNA? 然后PCR扩增？如何设计引物？我初做试验，望高手指教。

作者: PCR 时间: 2015-10-10 10:36

请问如果用焦磷酸测序方法测P53基因中的一段特定序列（20多个bp）有无发生点突变，可以用此方法不？如果可以，大概分那几个步骤：抽血提DNA? 然后PCR扩增？如何设计引物？我初做试验，望高手指教。

作者: 穿越时空 时间: 2015-10-10 10:37

弱弱地问下，做这个费用怎样，怎么计算花费？

作者: qumm1985 时间: 2015-10-10 10:37

我想问一下，为什么焦磷酸测序比BSP测序准确呢，它是怎么计算出单个CG位点的甲基化比例的？是高通量的测出每一个拷贝的甲基化情况然后计算出的甲基化比例吗？请高手指点。

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