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标题: 【分享帖】实验进度--从一个菜鸟开始 [打印本页]

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 16:06 标题: 【分享帖】实验进度--从一个菜鸟开始

从今天起，开始记录自己的实验点滴和文章情况。
很多外周血标本冻在-80度冰箱了，今天准备取出来，用AXYGEN的血DNA抽提试剂盒来抽提基因组DNA。不知道效果会如何。接下来继续PCR。引物借用文献中的，文献没附带的引物，直接往通讯作者的邮箱发邮件要的，第二天就回了，真的很感谢。引物送生工合成,HAP纯化法比较便宜，挺好用的，没发现有问题。
今天第一次跑SDS-PAGE。从生工买的蛋白Marker不好用，15ul的量，看不到清晰的条带。还是借用了师兄以前好用的Marker用的。上样的蛋白是目的基因PRF1转染CHO细胞之后的细胞裂解液，流式细胞仪检测到有目的蛋白表达，今天用SDS-PAGE验证一下有没有目的条带。

作者: seagate 时间: 2015-10-10 16:07

不算菜鸟吧楼主，看样子混实验室时间不短啊

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 16:07

PE-Cy5（替代PerCP）与APC不可以同时用在四色流式中，补偿无法调节。我自己的流式结果和我们实验室别人的流式结果强烈验证了这一结果。重新选抗体颜色的组合。
BD(Beckton Dickinson)公司的流式细胞仪则不同,其在早期即配置了四个检测通道,但不是由单个激光激发,而是由两个激光器激发,一个为488nm氩离子激光器,可激发FITC, PE和PerCP(BD的注册商标)[PerCP可被TC或PE-Cy5所替代].另一个为633nm的氦氖激光器,可激发APC.BD FACSCalibur机器即为此种配置,且具有软件调节补偿的作用, 可很好地调节FITC, PE, PerCP及APC间的补偿.但由于PerCP标记的荧光抗体种类比较少,所以在实践过程中多用TC(PE-Cy5)标记的抗体来替代。然而在使用PE-Cy5时，会经常发现补偿十分难调，PE-Cy5与APC间的补偿甚至超过90%, 有时根本无法调好。这是因为PE-Cy5为 "tandem"(阵列)型荧光染料，PE与Cy5依靠能量转移(Energy Tansfer)来实现荧光的激发与发射。而我们知道能量转移的效率有赖于两种分子间的距离，如距离稍有增加，则能量转移效率则会大幅下降，也就是说，PE-Cy5将分裂成两种染料，PE和Cy5。Cy5与APC具有相似的激发波长，在BD FACSCalibur机器中均可被第二个激光器所激发，因此造成补偿难调的情况。
那么如何解决上述问题呢？"诀窍"有几个：
滴定降低 PE-Cy5抗体的使用浓度,使得在不影响抗原检测的同时,得到较好的补偿调节PMT(光电倍增管)的电压(HV)，方法是:提高FL3通道的PMT电压，用以检测PE-Cy5。同时降低FL3通道的PMT电压，用以检测APC。目的是使在FL4通道中尽量减少对Cy5的检测量。
使用美国Caltag公司PE-Cy5.5标记的抗体来替代PE-Cy5标记的抗体，可以非常好的解决此问题。如其公司网站cuturl('www.caltag.com') 上的 PE-Cy5.5 Tandem Dye for Use in Multi-Color Flow Cytometry - flyer 所述,PE-Cy5.5与APC间的补偿仅为1.0%，非常的小。而且，PE-Cy5.5可与PE-Cy5,PE-TR,PE-Cy7等染料一起实现对细胞进行单激光6色的同时检测和分析。因此是最为推荐的解决方法。解决原理为PE-Cy5.5虽然也属"阵列"型染料，但Cy5.5比Cy5的激发波长要长得多，在700nm左右，因此可激发APC的第二激光器(633nm)无法激发Cy5.5,使得PE-Cy5.5与APC间的补偿非常小。
补偿是否容易调节还与PE-Cy5标记抗体的特异性和供应厂商有关。有研究表明，使用美国Caltag公司的CD5-TC时，TC与APC间的补偿比较难调，而用该公司TC标记的其它抗体，如CD19, MAC-1和HLA-DR等则比较容易调节补偿 .

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 16:15

昨天用淋巴细胞分离液分离了两支外周血，一支肝素钠抗凝，一支EDTA.K2抗凝，与K562细胞共孵育。后面一支血的活性明显下降。有点郁闷。今天上园子里来搜了一下，果然EDTA抗凝的血，不适合细胞培养。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 16:16

WB 用的蛋白ladder 买了Fermentas的，一支250ul，价格280元。每次上样10ul,条带非常好。推荐下。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 16:17

自己的中文的综述终于可以在线查阅了。虽然写出来的水平极其有限，杂志也极其普通，还是很开心。毕竟是自己真正意义上的第一篇文章。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 16:27

最近在制作会议用的壁报。本来自己用PS全部做好了，但是文字太多，图片不够多，重新返工。壁报返工，远比文章和实验返工要轻松，因为壁报的内容只是一片文章的摘要的内容。我们实验室有师兄热爱写SCI，每天不厌其烦地修改他的文章。结果就是他的文字很洗练，文章发的影响因子也比较高。不厌其烦，是一个非常有魔力的词语，在做实验和写文章上。必须学习热爱这种重复性的生活。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 16:28

老板如果给你课题了，这还是比较乐观的。这种情况下，用Pubmed搜一下自己相关课题的最近3年的文章，看看自己这个课题国内外发文章的套路。
国外作者的文章需要哪些核心实验支撑，自己的实验室有没有这些实验条件。如果有，自己需要多久、需要通过什么途径掌握这些实验技术。国内作者已经做了哪些实验，自己要做的话，还有哪些创新点（比如，你收集的病例的地域性目前还没有人发文章，或者你收集的病例数比人家多，或者你做的实验在机制探索上可以比别人的更进一步，等等）。一个小的创新点，加上可靠的实验结果，就有可能出一篇不错的文章。
如果你的课题需要你自己确定，老板只是给你一个方向，那你一定要反复跟老板沟通，看他潜意识里比较希望你研究哪个课题；他自己比较擅长的方向是哪几个；你老板以前发的文章，都写的是什么（中国知网、维普、万方、Pubmed，把你导师名字输进去，自己查就可以）。确认好课题之后，就可以了做了。
或者也可以先熟悉实验技术，课题在练习技术的过程中慢慢确认。
我刚进实验室的时候，课题老板已经给了。我的问题主要是自己特别雄心壮志，老看cell/science/blood这些杂志，自己课题相关的小文章读得不够多；学实验技术时，贪多，什么都学，没有专心于自己课题相关的几项核心技术。这样下来，吃了很多苦头。现在终于进行深刻的自我反省和改正。
祝你早日找到自己的重心和方向。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 16:29

昨天和今天第一次跑全套的Western Blot.
用外周血1.5ML,淋巴细胞分离液分离，4度预冷的PBS洗两遍。细胞裂解液500UL+蛋白酶抑制剂（MG 5UL+PMSF 5UL）冰上裂解30min。取30UL裂解液，加6×SDS裂解液6.6UL, 1M DTT 4UL, 100度煮沸 5min。
胶提前做好了。电泳。每孔上样20UL, 100V 10min, 120V 60min。
转膜。按照阳极、海绵、滤纸、PVDF膜、胶、滤纸、海绵、阴极，放好。三明治一半泡在转膜液里。冰上转膜，120V 60min。膜转的挺好看的。
封闭液加好，将PVDF膜放在4度冰箱过夜。
今天。
在5ML封闭液中加2ug一抗，室温孵育2h。摇床速度调的低速。
1×TBST,漂洗三次，每次20min,每次换新液。
在5ML封闭液中加1ug二抗，室温孵育2h。摇床速度还是调的低速。
1×TBST,漂洗三次，每次20min,每次换新液。
显影。暗室，A液+B液各5uL 混匀，放置1min后滴到保鲜膜上的PVDF膜，结果：无荧光。
接下来的显影、定影和冲洗都忘了做，直接把胶片压好后拿到室外白光下了。结果就是：肯定没有条带。
问题出在哪一步。
1.细胞数不够多，即上样的蛋白含量不够；
2.孵育时封闭液过多，一抗和二抗孵育效果不好。
3.抗体有问题。
4.细胞裂解液中不存在目的蛋白。
暂时总结不出别的原因来。下次再做，先把第一和第一条的原因纠正了，看看会不会有目的条带出来。

作者: @STAR@ 时间: 2015-10-10 16:29

楼上的兄弟，你的内参跑出来了没？

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 16:30

QUOTE:

原帖由 @STAR@ 于 2015-10-10 16:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼上的兄弟，你的内参跑出来了没？

内参当时没抗体了，没做。再做一定要加内参。正在买抗体。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 16:31

最近除了跑PCR之外，主要的事情就是写文章。
实验室的PCR仪坏了，开机总是显示UNIT FAILURE，宝诚的机子。公司拿回去修理，说是主板坏了，要两万元。剩下的就是等待。宝诚修理PCR仪很慢，以前我们实验室这台PCR修过一次，用了四个多月才修好。
现在用跑定量的PCR来跑普通的PCR，然后测序。感觉大材小用。
实验室的师兄连着发了两篇meta-analysis，这让还没有SCI的我，倍感压力。投稿的YMJ，总是每天登录上去看状态，一直是view。不敢催稿，等待的过程中心里基本都是不乐观的想法。新的文章，总是写着写着就卡壳，不知道自己到底是要写一个什么样的结论。无论如何，一定要写出来。同时，也想尝试着去写meta，多会点东西，总是好的。
老板要求把实验流程全部流程化，感觉有难度。实验步骤，也没在电脑上打成WORD版本。有很多事要做，希望自己能有自信。没自信的时候，很多事，感觉都做不下去了。
希望文章有消息。给我一个激励吧！煎熬大半年了。

作者: eric930 时间: 2015-10-10 16:31

可以直接保存外周血，待用时再提取DNA行多态性检查吗？我现在好郁闷啊，老板没有给课题方向，自己找，太迷茫了啊

作者: eric930 时间: 2015-10-10 16:40

还有咨询一下，用流式细胞仪检查细胞受体表达情况，外周血怎么保存，非常感谢

作者: xevin 时间: 2015-10-10 16:40

WB 用的蛋白ladder 买了Fermentas的，一支250ul，价格280元。每次上样10ul,条带非常好。推荐下。

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其实4-5ul足够了别浪费亲

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 16:41

从临床收特定的标本。做基因和蛋白检测。文章要是写的好，估计还可以写两篇临床的文章。我们实验室的师姐和师兄有不少人剑走偏锋，边做实验，边找临床资料，发SCI。或者直接写META。我写文章的功力有点差，一篇中文的综述，连写带改，就来回折腾了四个月。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 16:41

外周血可以直接冻到-80°的冰箱。抽提DNA效果还不错。
试剂盒我以前用的是AXYGEN。前段时间很奢侈地用了一个QIAGEN的。最近换成了Roche的。都提得出来。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 16:42

还有咨询一下，用流式细胞仪检查细胞受体表达情况，外周血怎么保存，非常感谢

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流式细胞仪检测，我们外周血都是当天的。有时候可以用4°冰箱放到第二天，但是细胞碎片会大大增多，抗体检测结果会有不小的误差。
如果你一定要保存，建议把单个核细胞分离之后，冻存盒冻过，然后放液氮。之后用的时候，再复苏细胞。不过复苏之后的细胞，状态常常很不好，要养好，得在培养基里加特定的细胞因子。这种方法太烧钱，我自己没用。我们实验室有老师用过，后来也放弃了。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 17:04

其实4-5ul足够了别浪费亲

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了解。刚开始做，怕没条带，特意加足量。条件摸好后，肯定得减量。省钱是做实验的一条常规。
多谢提醒。

作者: yapuyapu 时间: 2015-10-10 19:53

楼主一直都很努力，加油！
做PCR时引物设计好难搞定啊，最近要做普通PCR，引物弄了好几天了也没个头绪，文献里的引物也不知道是个什么情况，唉，总感觉做实验好想大多数时间都是自己在自学

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 19:55

QUOTE:

原帖由 yapuyapu 于 2015-10-10 19:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主一直都很努力，加油！
做PCR时引物设计好难搞定啊，最近要做普通PCR，引物弄了好几天了也没个头绪，文献里的引物也不知道是个什么情况，唉，总感觉做实验好想大多数时间都是自己在自学 ...

PCR引物我自己是用Premier5.0设计的。设计出来的引物，有的好用有的不好用。跟软件的评分不成正相关，软件评分高的，实际跑PCR，不一定跑得出来。NCBI的Blast,也是一样的。
PCR跑不跑的出来，同时跟DNA提取的质量相关。DNA质量好、浓度调的适中，PCR效果相应就好。
文献引物。我试过。三分之二的还不错，三分之一的会烂到你觉得是不是压根就不是自己要的引物。
因为自己设计的引物有时候不好用，我就找文献，核对一下，确实是我需要的引物，就找公司合成（一般选PAGE纯化，试过HAP纯化法，貌似效果也不错，虽然公司都强烈推荐PAGE）。PCR跑完后，一样的惨不忍睹。有时候还不如自己设计的。
有些引物，还是从大牛的杂志上找的。
后来写邮件给过通讯作者，人家很友好，第二天就把PCR相应的条件和使用的酶都发给我了。在此，表示感谢。没想到人家一大牛，对于我们这种实验菜鸟，也会热心回复。这种科研精神，使我激动了半天。
不同的引物，要用不同的酶，不同的条件跑，才跑得出来。至于条件和酶的种类，就自己试吧。
结论是：有些特定位点，引物效果就是不好。不管是自己设计的，还是大牛的文献里的。大家将就着用吧。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 19:57

今天下午又接受了洗礼了。
最近的实验做的不太顺(其实一直没觉得自己哪个实验顺过)，只是有些实验想对不那么糟糕。
BD公司买的透膜剂用完了，临时自己配了Triton X100,0.2%，代替用来透膜。结果，即使只是室温透了三分钟就洗，细胞还是死了一片，全体缩水。流式结果惨不忍睹。
为什么做实验没计划，试剂不会提前订？我承认，我做实验常常是用到了，才会想起来某个试剂是我需要的。而且，我以为一些试剂可以替代使用......
终于知道BD公司为什么做的这么红火了。人家的配方，要是能让一个实验菜鸟随便配点试剂就取代了，人家一小瓶几千块的试剂卖给谁呢。
我再次确信，牛跟不牛之间，这差距牛人懂，菜鸟永远是摔了跟头才懂。噢，原来真的差这么多！
后面几天要开会去了。今天晚上的飞机。想到去开会，展示个壁报，我都没信心。文章涂涂改改，我觉得丢脸极了，怎么怎么就能这么挫。这几天压力大到胃胀，到网站写了点小说。突然之间意识到，说不定我写小说也比我做科研有能力。
SCI。我追你。我等你。我写你。我改你。
然后，有一天，你来追着我。到时候，我就不稀罕你了，我想多少写多少！
我这是多酸葡萄的心理。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 19:57

第一篇SCI终于发了！刚查到了稿件状态。
虽然在外地开会，但是在宾馆里忍不住激动得大喊大叫。足足过了十几分钟才安静下来，这十几分钟里，电话拨了三个，漫游也顾不上了。在电话里，我一直激动得语无伦次。好在家人和朋友深知我最近煎熬的心态，所以，对着我的激动，他们比我还高兴。
终于发了！
终于有一点信心，去写下一篇文章，继续做实验。
附张图，终于可以高兴一下，今天就张扬一下吧。明天肯定就完全冷静下来了。

图片附件: 97741584.jpg (2015-10-10 19:57, 26.32 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=37909

作者: wawa 时间: 2015-10-10 19:57

楼主的科研精神和拼搏的态度我要向你学习，同时也祝贺你取得的进步，我相信你在以后的学习中肯定还会继续出SCI的

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 19:58

SCI肯定要继续写的。能写，应该就能发。现在稍微有点这样的信心了。
第一篇SCI发了，真的可以给予自己一点信心。
我的实验做的不好。做的实验不算少，逻辑性有点差。每次看有文章的人，我就会没自信。觉得自己是不是哪里有问题，而且，到底要如何改进？一直这样烦恼。
这次出来开会，听了不少报告。我基本都是挑自己感兴趣的基因测序听。收获还是蛮多的。以前开会，基本都是临床诊疗的报告，很少能像这次一样，可以自由选择自己想听的偏基础部分的报告。
SNP, 甲基化的做法和分析思维，Meta分析的idea如何找准一个点。这些都给了我启发。另外比较重要的就是内含子部位的SNP，到底如何影响基因表达，从而引发疾病，这次的会议中，我也有点思路了。后面要好好去做实验。
一起努力。
附：多谢你的认可。认可就是一种无言的鼓励。鼓励会渐渐产生信心。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 19:58

谢谢。
昨天我兴奋得到了半夜两点多才勉强入睡。文章煎熬好久了，昨天一下子知道终于接收了，高兴的心情实在无法自我克制。
今天起来就比较平静了，只是一天的会议上都很困。
论文有一点创新、逻辑相对严谨、结果可靠并具备重复性，语言再模仿一下母语人士的文章。基本文章就有希望了。以后做实验，应该会稍微有点逻辑了。
祝你实验顺利。

作者: summerxx 时间: 2015-10-10 20:06

祝贺楼主~
还想请教一下关于引物设计的问题，我现在基本处于白板状态，身边也没有可以学习的人，现在老板让做一个基因的PCR然后拿去测序，DNA马上就提完了，可引物还没有解决，不知道怎么办呐，如果让公司给设计引物行不行呢？我都需要提供什么信息呢？

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 20:08

你这种情况，让公司帮忙设计引物，是比较合适的。
公司会免费帮你设计引物，引物合成时才正常收费，一个碱基1.2~1.5元，看你选择哪种引物纯化方式。
你只给公司提供你想要的基因名称，以及基因种属（你做的是人的，或者哪个物种的）。
公司的话，选择英骏或者华大都不错。看你们那边的实验室，这两个公司（或者其他公司）谁在你们那边比较有庞大的业务网。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 20:09

会议回来之后，时间过得好快。
迎新，组织活动，报销，忙忙碌碌，一周已经过去一大半。前段时间养成的习惯都还在，每天继续去PONE刷屏，继续隔天写章小说，然后每天上去看看读者人数。
似乎，刷屏可以缓解内心的某种压力。
实验室新一届的学生已经进来了。我的实验，也应该找对方向，努力前行。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 20:09

今天在园子里看了看，投稿P ONE的文章，Required Reviews Completed已经三天，之前一次是大修修回。
Required Reviews Completed时间越久，结果越不乐观。自己估计应该是个Major revision,或者reject.
再等等看。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 20:10

Required Reviews Completed持续中。自己又开始坐立不安，什么都做不下去。
即便自己已经预料，Pone二审结果可能不乐观，不知道为什么，还是不淡定，一直在等待一个结果。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 20:11

今天刚学会用ISI Web of Knowledge。以前都没怎么意识到去用它。惭愧。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 20:12

今天实验室的流式细胞仪突然发飙。正在跑着，突然就跳出一个窗口，然后就苹果机就没反应了。
找了我们实验室流式老手，一看就知道废液箱堵了。
所以，跑了这么久的流式了，我今天才第一次知道，Tank “OK” or “FULL”，原来还有这个提示作用。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 20:18

Required Reviews Completed继续持续中。
晚上做梦全是文章被拒的消息。
清晨爬起来开电脑，第一件事就是刷Plos ONE的屏。还是这种状态。
我最近又开始心焦了。每天都处于这种状态中。不过，这是必然的，没什么好说的。
只是自己记录给自己看吧。
平心而论，现在在等结论的这篇文章，我写的时间最久，改的最多，结果并不那么确信。
虽然文章其他可能还可以，但是关键数据得出的结论，是有缺陷的。
这个缺陷，应该还是很要紧的。
文章消息等得越久，越不安。期待审稿人的二审意见可以给出有益的建议，即便这家杂志拒掉我了，我也可以再次找到自己能修改的地方。从而，进行下一次的投稿。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 20:21

Required Reviews Completed第15天。继续等待中。
清醒地煎熬。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 20:24

Required Reviews Completed第16天。
等待总是极其煎熬的。
想要一个小修。
大修，不知道会让修什么。
拒稿，就更不清楚下一步要做什么了。
心情就是在这种反反复复中，来回纠结。
昨天细胞又污染了。今天实验也不想做。写文章，思路总是不齐，写着写着就偏离主要道路。离自己预期的投稿日子，一天天拖下去。真是很心焦。
生活中，也遇到了很大的瓶颈。想要做的事情，总是困难重重，感觉被别人搀扶着前进，茫然。
无论如何，既然生活给了机会，就算再难，也想去试试看。
不尝试，就不会知道自己可以走多远。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 21:13

只要有实验数据。
就按照别人文章的样子，一样写出来。
写完了，改一下。投稿就可以了。
有什么难的呢？
这么简单的步骤，只要照着做，不就可以了吗？不需要犹疑。直接去做。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 21:13

Decision in Process.刚才状态变化了。
估计今晚或者明天，就给结果了。
希望是个小修。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 21:15

焦虑。几乎看见Reject在自己眼前跳动了。不知道二审是什么意见。
希望是个小修。
焦虑中。持续焦虑。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 21:17

相关疾病：
失眠
今晚注定要失眠了。Decision in Process.
感觉到一种内心的孤寂。这种煎熬的感觉，除了自己，没有任何人可以帮忙。
最近几天，发现很多事情，都与自己的初衷，有很大的背离。事实证明，没有任何一个人，可以随心所欲。想要做事情，就必须经过痛苦的挣扎。
无论如何，希望自己经历过内心的煎熬之后，可以更上一个台阶。这是自己对自己最好的回答了吧。
我一定要做到自己想做到的事情。无论多痛苦。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 21:17

相关疾病：
失眠
决定睡觉去。
这么失眠法，实在也不是个事。
明早起来，等判决吧。
今晚能睡着会，还是去睡会。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 21:18

Decision in Process，持续中。
今天的早饭，感觉都在胃里堵着。
说老实话，对自己的修改稿不是很有信心，虽然能改的部分，我都改了。能回答的问题，能补的实验，都尽力做了。
不过，不是尽力了的事情，就一定是合格的。
昨晚跟今早，人都处于极度紧张中。
哪怕等回来个小修意见也好。这会守着电脑，实在不想做别的事情。
等到结果了，才会有下一步的行动吧。
等吧，等吧。除了等待，也没有别的办法。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 21:19

相关疾病：
瘫痪
本来以为给结果会很快的。
但是，过去一天多了，状态还是没改变。
可能编辑忙，也可能文章实在不好，编辑正在整理资料，斟酌着给我回拒稿或者大修的信吧。
等待，总是各种不好的想法，层出不穷。
期待是个好结果，但是，自己无法麻痹自己。所以，等待就是唯一的方式。
今晚不等了，明天再登录看状态了。
貌似国庆和中秋节只有咱们再过，编辑应该不放假的吧。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 21:20

刚从会议回来。有很多感慨。
文章的状态看了一下，还是Decision in process.
估计要再等一段时间了。今天应该不会出结果了。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 21:20

五分钟之前，状态变了。等到结果了，Reject。
意料之中。
审稿结果，取决于文章本身的质量。文章不够好，就不侥幸要一个好的结果。
后面，要好好努力。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 21:43

趁着这会想法比较多，就说说自己对于自己文章的想法。
缺陷1：失去了创新的部分，新的突变成了SNP；
缺陷2：测序样本的缺失，无法补内含子部分的实验；
缺陷3：WB检测蛋白，缺乏相关实验和图片。
优点1：文献整理的很细；
优点2：各种相关数据收集的比较齐；
优点3：语言OK。
很显然，缺陷是致命的。优点是不显眼的。拒稿是应该的。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 21:44

不成功的经历，也是一笔财富。
把缺陷改了，继续换家杂志投。
屡败屡战。
能者多劳的幸福。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 21:44

纪念一下此刻的逊样。希望以后自己可以变强。

图片附件: 12590650.jpg (2015-10-10 21:44, 4.57 KB) / 该附件被下载次数 23
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=37910

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 21:44

基于CDl07a标记流式细胞仪检测NK细胞毒性方法的建立
1 调整效应细胞PBMNCs浓度为1×10-6/ML,．K562细胞作为靶细胞，效：靶=3:1。37℃ 培养箱孵育2 h。
2 加莫能菌素（2 umol／L)继续孵育3．5 h。原因：为阻止转运到细胞膜表面的CDl07a分子因膜内吞而降低检测阳性率，Alter等使用莫能菌素抑制细胞膜的内吞。防止假阴性。
3 加CD107a 和CD56抗体孵育半小时，PBS洗涤，溶血剂固定。PBMCs同时仅用佛波脂醇(PMA）和离子霉素刺激作为阳性对照。原因：若CDl07a抗体在PBMCs与K562细胞刚孵育时就加入培养体系，该抗体可能与很多低活性状态 NK细胞(细胞膜通透性增加)内囊泡上CD107a分子结合，导致检测结果的假阳性。
4 流式上机。
结果(CD56设门)：
PBMNCs自发表达CD107a: 5.8%;
PBMNCs+K562刺激组表达CD107a: 21.7%;
PBMNCs+佛波脂醇和离子霉素阳性对照组表达CD107a: 22.1%;
验证实验1：
方法：PBMC体系中(不含靶细胞)先加入CD107a等抗体，孵育1小时。实验组：加入莫能菌素孵育继续孵育4 h。阴性组：不加莫能菌素，孵育继续孵育4 h。
结果： CD107a抗体表达率实验组83.00% VS 对照组 7.7%。
结论：莫能菌素会导致假阳性率。
验证实验2 ：
方法：第l组在PBMCs与K562混合孵育的同时加入CDl07a抗体，2 h后加莫能菌素继续孵育2 h，CD56抗体标记半小时;第l组的对照组：PBMCs加入CDl07a抗体孵育2 h，加莫能菌素继续孵育2 h，CD56抗体标记半小时;
第2组在PBMCs与K562混合孵育2h后，加入莫能菌素继续孵育1．5h，CD107抗体联合CD56抗体标记半小时；
第2组的对照组：PBMCs加入莫能菌素继续孵育1．5h，再CD107抗体联合CD56抗体标记半小时。
结果：第一组 PBMCs组59.2% VS PBMCs+K562组 44.2%；
第二组 PBMCs组1.2% VS PBMCs+K562组 10.3%；
结论：正确孵育顺序为先莫能菌素孵育后，再用CD107a抗体标记。
验证实验3：
方法：效靶比分别为1:3, 1:1, 3:1
结果：效靶比1:3组15% VS 效靶比1:1组19% VS 效靶比3:1组32%
结论：本方法具有较好的敏感性，不需要较高的效靶比就可以得出可靠的结果。

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 21:45

总结：
1 细胞膜表面CDl07a自发表达率为1．2％～5．8％。
2 莫能菌素虽然可抑制NK细胞膜的内吞，却对NK细胞的活力产生一定影响，预先加人CDl07a抗体长时间孵育将引起严重的背景染色。
3 为阻止因细胞膜内吞导致CDl07a检测的假阴性结果，莫能菌素的使用绝对必要。
文献：
AIter G，Malenfant JM．Altfeld M．CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity[J]．Immunol Methods，2004. 294：15．
龚春香1一，王长荣1，龚卫娟1，胡茂志3，季明春. 基于CDl07a标记流式细胞仪检测NK细胞毒性方法的建立. 实用临床医药杂志.

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 21:46

Relationship between CD107a expression and cytotoxic activity
21个健康人 (10 位女性和11位男性)；
5×10-4/ML个细胞，检测CD107a自发表达率；
PBMNCs+K562细胞，效：靶=5:1，加CD107a抗体，同时加IL-2 (50 U/ml）或者IL-10(50 ng/ml），37℃ 培养箱孵育1 h。加入莫能菌素monensin (1 uM）继续孵育4H。
PMA（50 ng/ml）+Ionomycin（250 ng/ml）作为阳性对照组。
标记CD3 CD8 CD56三色抗体。1% 甲醛（paraformaldehyde）固定。
流式上机。
文献：
Relationship between CD107a expression and cytotoxic activity

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 21:46

Endnote X3, Download an archive of all available styles:
cuturl('http://endnote.com/downloads/dla/styles.zip.')

作者: wiwi 时间: 2015-10-10 21:49

这个里面的期刊Style,不全。比如，Journal of Pediatric Hematology/Oncology就没有。
目前自己还不会手工编辑新的Style,只好用最笨的办法：先用格式相近的期刊统一文献格式，格式不同的地方自己手动修改。
话说，自己手动编辑新的Style的教程，我怎么看不懂。

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