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标题: 【求助】3T3L1分化时飘了，越飘越多，分化不成功 [打印本页]

作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 16:32 标题: 【求助】3T3L1分化时飘了，越飘越多，分化不成功

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我之前的分化效应可以说相当好，而且细胞冻存都保存在液氮中，每学期拿一只出来复苏分化，很好。我可以给大家秀秀以前的分化染色图。这是第8天的效果。

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作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 16:33

但今年开学一连复苏了3管细胞，均是分化前一切OK，分化第一天细胞状态也都正常，但到第2天，细胞就开始出现飘的多，飘细胞内出现浓缩颗粒，类似凋亡细胞，接下来就慢慢的飘的更多了，基本不分。
给看一张第一天的细胞，形态都很正常。细胞变圆，两头出现长长的细丝，我给取了个名字叫“双尾蝌蚪”，只要出现这样形态，我就放下了90%的心，但这次不同，虽然第一天很好，到第二天细胞就开始飘，越飘心越凉啊……

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作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 16:33

这是第2天的情形，看箭头所指，圆形漂浮的细胞，胞内可见固缩的高密度物质，极像凋亡细胞！
同时把以前分化很好的图片给大家做一个对照！左图正常分化中：细胞变圆，变大，长出细长触手，而右图细胞轮廓不清，出现漂浮细胞！！！！

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作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 16:34

到了第4天，基本就放弃了，大部分细胞没有分出来，我都快要郁闷死了。
左图正常分化中，细胞进一步变大，变圆，不分细胞内可以看见小的脂滴；右图中细胞轮廓不清，漂浮细胞多见，完蛋了。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=38012

作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 16:35

细胞都是1年半之前，09年4月协和细胞库买来后就冻存的，当时大量冻存在液氮罐中，大约有百十来管，就是为了防止细胞老化后分化不好的问题，代数在10代以内，之前复苏分化一直没有问题。前脂肪细胞生长没有问题，同学用作增殖模型，我复苏后传给她的，如MTT实验，都有效应，并和以前实验结果可以重复。
我这学期复苏了3次细胞，因为每次都怀疑是细胞种子不好，可能换一管就可以了。看来不是细胞的问题，试剂是否有问题？
分化的试剂IBMX是这学期刚分装的，都是Sigma定的，方法和最开始一样，应该不会出问题。但胰岛素和地塞米松都是细胞买回来时分装的，冻存在﹣20度，已经放置了1年半，所以只能怀疑是胰岛素和地塞米松过期的问题，我现在已经重新订购了胰岛素和地塞米松，准备换试剂后再试试！
只能走一步看一步了。
我会持续更贴告诉大家最新进展的。但这个细胞分化真是个漫长的过程，一次就要15-20天的周期，不成就要重头来，真能把人给逼疯了！！

作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 16:35

我已经无计可施了，我重新配了胰岛素，地塞米松，IBMX,我更换了培养基，更换了血清，能check的我都check了，都没有改变。都没有心情写了……
现在只剩下细胞了，今天刚打了电话，重新订购了3T3L1，从协和细胞库，如果买来的细胞还不成，实验作了大半，进退维谷，我明年6月是毕不了业了，我退学算了，反正在哪都是被人剥削，都一样，疯了，死的心都有了！！！

作者: summerxx 时间: 2015-10-14 16:36

3T3L1的分化对培养环境非常敏感，甚至是trypsin的质量都会影响分化。你这个现象比较诡异，换了这么多还不行，结合你的描述，细胞还大量飘起，多半是细胞和血清的问题，而不是简单的不分化的问题了。一般的试剂质量有问题最多导致不分化。
但你的细胞又是同一批保种的，之前取出来都正常。所以除非细胞后续的保存出了问题，或者血清污染了支原体，你确定更换的血清也是好的？培养基是自己配制的还是买的液体？自己配制的培养基，水源有没有检测过pH正常，电阻值正常？还有一个办法是全部使用其它实验室的培养体系（当然确保他们用的东西，都是高质量的进口试剂和溶液），看看有没有问题。

作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 16:36

多谢楼上的兄弟回帖，看了你的建议，我又重新回顾了一下最近的实验，想再总结一下。
昨天情绪极其低落，以至于都发的帖都难看啊。
这学期以来，一共复苏了6瓶细胞！！！有8代的，10代的，不超过12代，我的方法是直接加10ml完全培养基（DMEM+10%CS），放培养箱4小时，观察细胞贴壁后弃去以上培养基，更换新的培养基过夜培养。2天以后再换培养基，如果长到70%就及时传代。每批细胞复苏的贴壁率不等，都还可以，最多不超过8小时，都可部分贴壁，含DMSO的培养基没有过夜培养的，复苏后再次传代时间也不超过4天，3T3L1细胞长的很快，又不能长太满，所以4天以内都可以传代了。
这学期的培养基刚开始是自配的，血清都是HYCLONE的，包括CS和FBS，一直是同一个供货商，其他同学都用，都没有异常。
胰酶这学期配的，但是以前我们加EDTA，这次那个配的同学不知道为什么，就没有加，所以消化时间的确有延长，以前一般消化1分钟，基本大半都下来了，现在消化时间延长到5-8分钟，但绝对没有超过10分钟，回种后细胞生长正常，过夜贴壁很好，然后如果1比5传代的话，3天以内就可以再传了，个人觉得生长速度没有改变。
一般传2代之后种皿，一般一瓶75cm的细胞我可以种4个6孔板，细胞很够，回传比例是1比10,4天左右就可以再次种了。
皿继续DMEM+10%CS培养到长满后2天，一般需要5-6天时间，换DMEM+10%FBS和分化试剂，第一天状态很好，细胞变圆，变大，飘的细胞很少，第2天换胰岛素的时候感觉还好，飘的少，可是到3天，飘的细胞就多了，接下来基本每况愈下，那个飘啊，就不提了，那个心情啊，一天比一天差啊……
发现问题后，我立刻重新配胰岛素，地塞米松因为订不到新货，只能把以前用乙醇配的（第一次配置的储备液，用PBS稀释后分装，分化成功过），放在-80°，拿出来用PBS稀释后分装，IBMX夜重新配了，都是按照最开始的方案，都是最开始用的货物批号。
同时更换了培养基，订购了迈晨公司配置的液体DMEM，设计了一大套对比实验组，基本就是4种变量：培养基，胰岛素，地塞米松，IBMX，分别有两批，旧的和新的，用排列组合的方式，一一对照，当时做的，那个疯啊。
分化后第一天，各组没有明显不同，到第二天，发现凡是旧的培养基，细胞飘的多，当时心中狂喜，是不是培养基出了问题，结果，到了第3天，新的培养基也飘了， 4天，分化细胞少见，到了第6天，各组差异全部消失，飘的飘，贴壁细胞也是层次不清，一塌糊涂！！这个实验只能证明我的试剂，新旧没有差异！！但是，都没有用！！哎呀，我写到这，真的想骂人啦。
昨天订购了新的细胞，大约1周以后可以去拿（协和细胞中心），然后，找公司订了GIBCO的血清，以前GIBCO和HYCLONE的血清我都作过，差异并不大，都能分出来。现在，基本没有什么是不可以怀疑的了，只能试试看。今天有申请了HYCLONE的澳洲血清试用，这个比我现在南美血清要贵一些，看是不是可以改善啊。
楼上说的问题，“但你的细胞又是同一批保种的，之前取出来都正常。所以除非细胞后续的保存出了问题，或者血清污染了支原体，你确定更换的血清也是好的？培养基是自己配制的还是买的液体？自己配制的培养基，水源有没有检测过pH正常，电阻值正常？还有一个办法是全部使用其它实验室的培养体系（当然确保他们用的东西，都是高质量的进口试剂和溶液），看看有没有问题。”都非常关键，在此小妹谢过啦。
照着分析一下，实验室细胞保存在液氮中，液氮罐不是每周补充，但没有空过，就是补充的不定期，有时候很多，有时候很少，会不会这个也影响细胞啊……疯了！！
血清支原体污染不确定，但实验室的卫生条件一般，确实有问题，我打算购买支原体抗生素，以后这个常规加吧。
水是中科院一个公司的，用了快1年，全实验室都用啊，就是我出问题……再一次疯了！！！
这几天又去公卫楼买了去离子水，北医的公卫楼的水据说是不错，2块钱一升啊，价格也不错！以后配东西用这个！
我们的培养箱，是松下的，大家用的都没问题，就是我的细胞不成，我也不知道该不该考虑是它的问题！疯了！！！
其他实验室的体系用起来，操作实现起来比较麻烦，到最后不行再努力吧。
准备订购液体胰酶，自己都不敢配东西了。
现在进展如此，疯了！疯了！！！同学都拿我当反面教材，考虑是不是要同时作2个独立的课题，这样不至于向我一样，毕业前挂掉！！！老板都不批评了，同意我随意订购昂贵的试剂！！
有新进展，我会再说出来，现在，基本用无谓的体力劳动充实自己死掉的心。这一周，把自己所有的塑料，玻璃容器都重新超声，泡酸，清洗了一遍。
WHAT ELSE CAN I DO?

作者: summerxx 时间: 2015-10-14 16:36

看了你这个回复，相信你迈过这道坎之后，对实验的认识会大大提高，我做课题时遇到过的问题不比你少：），scientist是要锻炼出来的。
我给你举一个例子吧，我以前的实验室当初做3T3 L1分化，楼下一个实验室也做，有一阵子他们怎么都分化不出来，后来折腾几个月，找到原因，是因为trypsin从牛的换成了猪的。我想，不会有人想到这个问题，即使当时这个PI是国外做3T3 L1分化的鼻祖lab出来的，也没有想到过这个因素。当时他们的策略就是，不在自己实验室做实验，到我以前的实验室做实验，用我们的所有试剂，然后不断摸索和他们的试剂匹配，最后找到原因。
所以，我建议，你找一个实验条件比较好的实验室，去做实验。你可以直接购买进口的液体培养基，血清，trypsin，PBS（除了血清外，其它这三项，买1，2瓶都不贵的）。然后用别人的培养箱，平行做实验，试一试看。最佳途径是找一个也做3T3 L1的实验室，去他们那里做，先把实验做出来再说，实验原因有时间总是可以找出来的。

作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 16:37

谢谢楼上的鼓励，我每天都打开这个链接，看看，再想想，再看，总之，无论如何，我必须迈过去，所以向前看，尽自己最大的力量去try，调整最佳状态去try！
我还养着我的3T3L1,主要想对比一下以后的新细胞，今天把前脂肪细胞照了一张相，直接拿数码相机对着镜头照的，质量一般，也请大家参谋一下，看看形态什么的是否正常，个人觉得没有特别大的改变，不过，现在，没有什么事情我很自信了，呵呵。

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作者: summerxx 时间: 2015-10-14 16:37

你这细胞看上去比较小，不够肥大，我看你第一张图片，分化也还可以，但算不上高。
年代有点久远了，我回头帮你找一个我们养过的3T3L1分化染色图片和细胞图片吧。

作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 16:38

这几日主要清洗器皿，订购了液体的胰酶，PBS，gibco的血清，协和还没有给消息，希望这周可以拿到细胞。
又上ATCC看了一眼图片，细胞确实较我的饱满一些，但差异也不是很大。图片贴上来大家也能看看。
目前怀疑有可能支原体污染，细胞房的同学比较多，管理上也比较松散，污染的可能性不小，现在只留了一瓶细胞，准备种玻片然后hoechst 33258染色看一下，如果怀疑就买一个检测支原体的kit PCR一下，确认是否为支原体污染。
我为什么读博士，只是因为还有一点求知欲和好奇心想知道为什么！！所以，虽然这批细胞估计是没戏了，但，死也要死个明白！！！自己给自己打气，一定要坚持到底！

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=38015

作者: summerxx 时间: 2015-10-14 16:38

支原体污染最主要由细胞源污染和血清污染导致，其它试剂你严格灭菌，过滤，一般不会轻易引入支原体污染，交叉污染只要注意操作也很少见，不像酵母，容易空气传播交叉污染。除非你实验室环境附近有什么特殊的带来支原体污染的东西。
要注意细胞来源污染。血清你这次用gibco的，不会有问题了，pbs也注意灭菌好，所以试剂要单独使用，不要和其他人混用。

作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 17:08

我已经从协和细胞库拿回来新的细胞株，但观察觉得状态一般，协和老师说这是复苏后第一代，所以可能需要再培养观察一下。
我已经传代，冻存了一些，现在种了小皿，过几天就可以分化，看分化的效果，然后再来告诉大家，只有能分出来，才是好细胞。给大家看看这张图，是协和细胞拿过来传代后第2天的效果，感觉细胞不够丰满，有些细胞轮廓不清，状态一般。
希望和我一样在实验中遇到困难的人坚持到底！给自己打气！

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作者: misswu61 时间: 2015-10-14 17:09

我也在做分化，分化率时高时低，完全可以体谅诱导等待中的焦虑心情，继续加油努力啊!

作者: seagate 时间: 2015-10-14 17:09

虽然做的不一样，我是个初进实验室的新手，两个月一直在做PCR一次也没有成功过，一起加油吧。

作者: caihong 时间: 2015-10-14 17:09

很可能是试剂的问题，我们都是每次分化之前现配。
顺便问一下，从协和买这样一株细胞多少钱？

作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 17:10

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原帖由 caihong 于 2015-10-14 17:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

很可能是试剂的问题，我们都是每次分化之前现配。
顺便问一下，从协和买这样一株细胞多少钱？

呵呵，在我的体系里试剂应该不是问题，首先，我配的试剂曾经顺利分化达1年半之久，其次，我在今年分化出问题时所有试剂又重新配了一遍，都不成，试剂货号，配制方法全都不变。现在怀疑还是细胞出了问题。但出现问题之后，分析起来就是一个黑箱效应，只能从外面猜，看不到里面。现在仍在研究中，但结果未确定，等些时候我会再更新。
另外，协和的细胞不贵，700元一瓶。

作者: vvmmoy 时间: 2015-10-14 17:10

我以前也做过这个细胞的分化，发现细胞开始分化后贴壁效果就比较差，会有很多细胞飘起来，严重的时候是整片细胞全部掉下来。后来每次种板前都先用明胶预包被一下，基本上在分化过程中细胞就不会飘了。

作者: PINK 时间: 2015-10-14 17:10

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原帖由 vvmmoy 于 2015-10-14 17:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我以前也做过这个细胞的分化，发现细胞开始分化后贴壁效果就比较差，会有很多细胞飘起来，严重的时候是整片细胞全部掉下来。后来每次种板前都先用明胶预包被一下，基本上在分化过程中细胞就不会飘了。 ...

如果你买的polysine处理过的dish，还这样飘，是细胞状态不好的原因，代数过老也会导致贴壁不牢。加明胶可以帮助解决问题，但最好还是更换细胞，不然实验结果也会有出入。
就像人们说293或者293T贴壁不牢，其实完全是误解，都是因为用的细胞代数太长了，状态不好了。

作者: seagate 时间: 2015-10-14 17:10

As my Experience, before diffirence, the 3T3-L1 has to be very dense otherwise the differenciation would be very bad. From the photo you gave in 220 of Oct, the dencity of the cell is too low to be differenciated.
Gas!!!

作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 17:11

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原帖由 seagate 于 2015-10-14 17:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

As my Experience, before diffirence, the 3T3-L1 has to be very dense otherwise the differenciation would be very bad. From the photo you gave in 220 of Oct, the dencity of the cell is too low to be d ...

多谢您给出的建议，的确，长满后2天分化的标准方案有它的绝对理由，我曾经试过长满后1,2,3天后分化，发现第一天的分化率严重偏低，基本是散在点状分布，第2天的分化率就很好，第3天再分化，情况比较复杂，有的时候会很好，非常好，有的时候就不好，总结主要和分化前细胞状态有关，长满后如果每天换液，保证细胞足够的养分，能够继续堆积，分化就很好，有时候稍微疏忽一点，细胞长满后很容易飘的很多，这时候分的就不好。
有人建议种皿后长6-7天，就分化，我用3万细胞/ml的密度，种6孔板2ml/孔，细胞基本是3-4天长满，计算下来也约是6天左右分化，我们有同学还是过用10的倍数梯度种皿，比如3千，3万，5万或更高的倍数种，发现无论如何，到4天左右都长满了，这个我没有尝试，呵呵，反正这个细胞长的确实非常快。
比如，无论你如何稀释，回传的细胞4-5天必须传代，所以这个细胞养的时候真的是非常累啊，不停地传代，种皿，分化，前一批实验结果未出，后一批的细胞必须种下，要不然周期太长，等不了啊。
以我的经验，3万密度种细胞，6天左右分化，效果比较的稳定，但每天查看细胞，根据实际情况分化是需要的。如果新手，可以稍微延长分化前时间，比如7天，但延长并不是绝对的，不是越长越好。
我的细胞长满后2天的图片目前没有，实在好久没有分化了，呵呵，所以养不到那么长的时间，等这批细胞合适的时候，我会种皿尝试分化，到时候请楼上的兄弟再给鉴定一下。
总之，多谢大家的关心和建议，都非常有用。

作者: cocacola 时间: 2015-10-14 17:12

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多谢您给出的建议，的确，长满后2天分化的标准方案有它的绝对理由，我曾经试过长满后1,2,3天后分化，发现第一天的分化率严重偏低，基本是散在点状分布，第2天的分化率就很好，第3天再分化，情况比较复杂，有的时候会很好，非常好，有的时 ...

3T3L1分化的标准流程就是要接触抑制2天再去做诱导，这个你应该知道的吧

作者: SO2 时间: 2015-10-14 17:12

我毕业就是靠这个分化的，很容易漂，对环境变化也很敏感。
insulin，地塞米松，分化的培养皿或细胞板，PBS......都会影响

作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 17:12

呵呵，抱歉很多术语，我可能说的不标准，以后要注意，改正。
您说的接触抑制，指的是否就是细胞100%长满，英文Protocol上说的是： Two days post confluency (DAY 0) stimulate the cells with MDI induction media，我理解是长满后两天开始分化，算作D0。
形态学上大致是细胞铺满瓶底，呈梭形排布，没有空隙，看不见空的瓶底，两天以后，细胞基本条梭状分布，很细，一个挤一个。和散在分布时多角形的形态大有不同。
我上面说的的确有很多不是标准操作，有很多也曾在坛子里看见过，有时候同学们也会互相沟通经验，但的确，标准方案是最通用的，我一直也是以标准方案为标尺。

作者: SO2 时间: 2015-10-14 17:12

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原帖由 雪花子 于 2015-10-14 17:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

呵呵，抱歉很多术语，我可能说的不标准，以后要注意，改正。
您说的接触抑制，指的是否就是细胞100%长满，英文Protocol上说的是： Two days post confluency (DAY 0) stimulate the cells with MDI induction media，我理解是长满后 ...

对，这两天不仅仅是细胞数量的问题，因为已经接触抑制了，细胞数目不会增加多少，关键是这个过程引入了许多信号通路的变化，最近还有文章报道引入了epigenetic change，所以正常分化实验中这个步骤不是随意可以调节的，但可以作为研究影响分化因素的一个课题来研究。

作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 17:13

相关疾病：
真的不愿意承认，但是，事实就是我的细胞污染了支原体，经过测试，现在公布结果。作为一个熟练工人，污染了支原体，实在让我羞于给大家报告，这种失误的确很低级，然后没有最先怀疑这一点，浪费了很多精力和时间在其他方面，这……唉。
同科室的同学做Confocal，顺便染了一个Hoechst，我发现背景不够干净，我怀疑支原体污染，非常怀疑。这是别人做的片子，我就不在这里给大家看了。我建议老板买一个支原体检测的KIT去做PCR，老板很鄙视，觉得花这份钱不值得，他觉得这有60%的可能，细胞直接扔掉就行了。
我也承认，一旦细胞发现支原体污染，直接放弃就得了。但是，我还是想最后确认一下是不是，因为不能用KIT检测，所以我没有所谓的阳性对照，或者阴性对照，那我如何判断这是否是支原体感染呢？
我采用了临床医生常用的一种思路，用抗支原体的抗生素，如果抑制有效，就证明是，如果无效，就可能不是。因为很多时候在临床，很多感染无法确定是什么，只能先用抗生素去杀，然后反过来说这种感染是对什么敏感的。
我的实验设计如下：

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作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 17:14

这是环丙处理3天后，组间差异并不明显。当天传代再处理，各种1皿。

图片附件: 39306141.jpg (2015-10-14 17:14, 47.39 KB) / 该附件被下载次数 20
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=38019

作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 17:14

这是传代后又2天，相当于环丙处理第5天，组间差异仍不明显。各种2皿，一个测Hoechst染色，一个准备分化。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=38020

作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 17:14

在第6天，其中一个小皿传代后种玻片，这是第7天玻片，组间差异不明显。

图片附件: 20217191.jpg (2015-10-14 17:14, 42.18 KB) / 该附件被下载次数 20
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=38021

作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 17:14

第8天，细胞经过2次传代，不加环丙组在细胞生长密度变大时，会出现更多的漂浮细胞或者碎片，与环丙组的差别日趋明显！

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作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 17:15

第9天，不加环丙组出现更多的漂浮细胞或者碎片，与环丙组的差别日趋明显！

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作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 17:15

第9天，细胞固定，Hoechst染色，confocal镜检，固定染色和镜下的实验条件都完全一样，这是低倍镜下，差异非常明显，非常明显，我不多说了。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=38024

作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 17:15

这是高倍镜的，非常明显

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作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 17:16

关于分化的那一批，出了匪夷所思的意外，目前没有很好的解释，所以暂不分析，待以后有结果再说。
关于支原体污染，思路迪前辈曾经也说过，常见是血清，细胞交叉，这两项我可以80%确认不是，血清都是hyclone，细胞我只养了这一种，枪头盒等都是每用一次就重新高压，因为细胞处理时间长，早期养的时候（1年前）我也出现过一次霉菌感染，所以已经很注意。
我现在分析最大的可能是细胞房环境不佳，我们细胞房管理很不好，因为有3个Team的同学都在同一个细胞房，大约20人左右，最糟糕的是，因为有的老师不以身作则，直接进去，不换鞋，不穿白大衣，更别说戴口罩了。所以，到今年6月份的时候，所有的人都不换鞋，不穿白大衣，细胞房随进随出，我也很无语，我只是个博士，我不是领导，我跟老板反映过，结果效果不理想，有很多人为地因素，也没什么好说的，我也不发牢骚了。
经过这次事件，我再次提醒老板，终于，上周重新更换了超净工作台的滤芯（还是2003年的），换下来的滤芯惨不忍睹。
更换了换气扇的滤芯，工人说早就坏了，不能用了。我上周每天晚上最后一个到细胞房，用84拖地，然后打开紫外灯后离开。每天早上坚持用消毒液擦拭桌面，培养箱表面，没办法，为了自己的细胞，就这半年了。
终于，细胞房重新贴上规定：请进细胞房前更换专用拖鞋，白大衣。
但愿这次坚持的时间长久一些。
等这次细胞分化顺利之后，我会将3T3L1的分化经验写出来，供大家参考。

作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 17:16

另外，我仔细check了我以前的片子，我在今年初做的一次confocal还是没有支原体污染，hoechst染色我们常规染，这里再给大家看一下，这又一次说明污染和分化相关性。分化好的细胞应该是没有污染的，我做的都是脂肪细胞的confocal。以前的片子颜色调的比较暗，因为不是为了突出核，只是一个定位而已。脂肪细胞又很厚，所以片子不好看。这次的染色比起来要好看些，这次是脂肪前细胞，特此解释一下。而且confocal的老师说我的实验技术又提高了，说现在做的更漂亮了，唉，这个多讽刺啊。
为了让图和文字配上，我发了很多次帖子，实在不知道怎样像博客那样，将图和文字穿插起来，所以请斑竹见谅。

图片附件: 15632420.jpg (2015-10-14 17:16, 38.64 KB) / 该附件被下载次数 19
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=38026

作者: SO2 时间: 2015-10-14 17:16

真的不愿意承认，但是，事实就是我的细胞污染了支原体，经过测试，现在公布结果。作为一个熟练工人，污染了支原体，实在让我羞于给大家报告，这种失误的确很低级，然后没有最先怀疑这一点，浪费了很多精力和时间在其他方面，这……唉。
同科室的同学做Confocal，顺便染了一个Hoechst，我发现背景不够干净，我怀疑支原体污染，非常怀疑。这是别人做的片子，我就不在这里给大家看了。我建议老板买一个支原体检测的KIT，老板很鄙视，觉得花这份钱不值得，他觉得这有60%的可能，细胞直接扔掉就行了。
我也承认，一旦细胞发现支原体污染，直接放弃就得了。但是，我还是想最后确认一下是不是，因为不能用KIT检测，所以我没有所谓的阳性对照，或者阴性对照，那我如何判断这是否是支原体感染呢？
我采用了临床医生常用的一种思路，用抗支原体的抗生素，如果抑制有效，就证明是，如果无效，就可能不是。因为很多时候在临床，很多感染无法确定是什么，只能先用抗生素去杀，然后反过来说这种感染是对什么敏感的。
我的实验设计如下：
......

==================================================

最简单的可以做个rtpcr确认，另外，你现在分化做出来了吗？

作者: ALALA 时间: 2015-10-14 17:17

LZ我好葱白你。通过这些帖子你让我看到了一个科学家是如何去面对问题，分析问题并解决问题的。上个月开始我的课题也接触到3T3-L1的分化实验，单单是细胞状态问题我就跟它耗了一个多月，想了各种办法还是解决不了，现在还在僵持着。你的经历让我学到了很多，不仅仅是技术上的，更多的是态度上的。谢谢你，也祝你接下来的实验顺利，明年顺利毕业。

作者: 分子式 时间: 2015-10-14 17:17

我也正在做这个实验，遇到同样的问题。请问，支原体污染了就不能再做了吗？加环丙沙星养可以吗？会影响它的分化吗？请教各位前辈指点，谢谢！

作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 17:17

首先，原则上如果确认支原体污染，就直接放弃，如果是珍贵细胞，比如自己培育的细胞株，或者无法购买的，只能用杀菌剂试试看。
其次，支原体抗生素环丙沙星在临床是有效的，但喹诺酮类抗生素对细胞生长和分化到底有什么影响，我现在也不知道，有市售的专门针对细胞培养支原体污染的抗生素，我记不得厂家了，搜搜就知道，但是价格昂贵，差不多要1000多，所以，还不如买新的3T3L1了。
为了预防支原体污染，能不能预防用药？比如用低浓度的环丙沙星，是否能找个浓度对细胞影响最小？我现在正在做这方面的尝试，但这只是个人经验，不知道可否推广，因为具体情况实在太多的不同，总之，细胞房的环境要保持，然后，操作一定要细致，有结果再来汇报。

作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 17:17

QUOTE:

原帖由 SO2 于 2015-10-14 17:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
真的不愿意承认，但是，事实就是我的细胞污染了支原体，经过测试，现在公布结果。作为一个熟练工人，污染了支原体，实在让我羞于给大家报告，这种失误的确很低级，然后没有最先怀疑这一点，浪费了很多精力和时间在其他方面，这……唉。
...

明天分化第一天(口误，是分化D0)，等下周一，结果就出来了。现在信心不大，经过这些事情之后。而且，我以前的细胞都是09年初冻存的，冻存的时候应该没有污染，因为曾有1年的稳定分化期，都是同一批冻存细胞复苏。就是从今年7月份开始，持续不分，这提示支原体污染是这个时期发生的，但到底是哪一个试剂出了问题，仍然找不出来。我这次新细胞已经全部更换buffer，但我还是缺乏自信。
再说，协和这次的细胞状态一般，镜下看不够丰满，长密的时候有些扎堆，然后看不太清楚，对比度很小，有人说是细胞贴的好才这样？不过，显微镜也不是很高级的那种，所以，呵呵，到时候就来报道。
然后，今天种了新细胞的玻片，下周也可以看看Hoechst染色，确认细胞无支原体污染。

作者: pore 时间: 2015-10-14 17:18

建议，买一包带0.22微米滤膜盖子的进口细胞培养瓶，重新复苏于其中，一切OK

作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 17:18

QUOTE:

原帖由 pore 于 2015-10-14 17:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
建议，买一包带0.22微米滤膜盖子的进口细胞培养瓶，重新复苏于其中，一切OK

多谢建议，但我们之前一直用corning的带滤膜盖子的培养瓶，但我真没注意滤膜的滤过尺寸。有论坛上说支原体是0.22微米滤膜不能彻底清除的，这个我就不是很专业了，不知道，还请有懂的同学多指教。
我也分析不出来到底是什么时候，是什么污染源导致了支原体污染。我想等实验一切正常之后，有功夫的时候，再取以前冻存的细胞，用新的体系培养试一下，但目前不敢再尝试了，先把课题完成吧。

作者: SO2 时间: 2015-10-14 17:18

相关疾病：
肺炎
楼上说的0.22滤膜够了，支原体一般在0.3um以上，虽然比常见的细菌小一些。
但环境因素引入了支原体，那是比较少见的，因为如我前面所说，一般是不干净的血清交叉污染导致的。还有一个就是操作者的因素感染，一般发生在人患了支原体感染疾病时容易发生，比如支原体引起的肺炎。你们实验室的人都要保持健康，记得常体检哦。

作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 17:19

新的细胞今日分化第4天，虽然脂滴看起来还不明显，但大部分细胞内都可看见散在的脂滴，而且细胞没有飘，状态还可，换液时能感觉到粘稠，一切说明还算正常，先把图摆出来，随后4天的图4天后送上，这次终于分出来了，经历了近4个月的摸索和尝试，今天才觉得天空稍微晴朗了点。
简单说明一下：
长满：细胞铺满，看不见空的瓶底，细胞呈条索状；
长满后1天：细胞更拥挤；
D0：过度长满，当时自己也并不自信，大家可以看到细胞有些还是飘了；加入诱导分化液分化；

图片附件: 44035824.snap.jpg (2015-10-14 17:19, 14.59 KB) / 该附件被下载次数 21
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=38027

作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 17:19

D1:细胞形态发生变化，两端长出细丝状，胞体变大，我叫他双头蝌蚪；
D2:胞体进一步变大变圆，细丝更长；
D3:个别细胞内出现小的脂滴，透光圆球形；
D4:大部分细胞内出现少量脂滴；
这次分化并不很好，但好歹是分了，分化率可能和我选择分化的时间等还有关系，所以可以调整提高。

图片附件: 58440026.snap.jpg (2015-10-14 17:19, 54.83 KB) / 该附件被下载次数 20
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=38028

作者: SO2 时间: 2015-10-14 17:20

不错，过几天看看你染色的结果。科学研究，很多时候乐趣不在于频繁的成功，而在于历经艰难之后的那一丝曙光。
btw：你的分化时间不是固定的？你还调来调去？：）

作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 17:20

您说的都到我心坎上了，在于历经艰难之后的那一丝曙光……
为了保证冻存细胞的质量，我一共分了5瓶细胞，然后分别冻存，然后这5瓶细胞我冻存同时各种了一个孔（6孔板），刚好一块板子。因为5瓶细胞的细胞数不尽相同，种皿的时候是约1比10稀释种的，没有计数（实在太花费时间了，这样冻存就耽搁了），所以皿里的细胞长的也有些差异，不像一起种的那么整齐，长满的时间也就不同，有的早上满了，有的中午，有的到晚上才差不多，还有的可能要等到半夜，呵呵，我不能严格按照长满后2天分化，所以取了一个大部分细胞都已经满了的过2天时候来分，呵呵，这就是我说的“我选择分化的时间”，应该是分化开始的时间，这个时间点这次并不十分严格，可能引起每个孔分化效率不一样，有的好，有的稍微差一些。
如您所说，分化开始的时间和分化液处理时间的标准方案都是经过长期实践积累出来的，最有利于细胞分化的方案，也有相当多的机制理论支持，这种方案我可不会轻易改变，这次主要是为了实际操作的便利性和可行性，人为地统一了开始分化时间，分化阶段分化液加入和撤出时间仍然严格按照标准方案执行。
比如，这两个孔的分化率就不太一样，但通过分化开始时间的调整，我想应该可以到更好的分化率。
我们有同学也采用3+3（诱导分化液3天+胰岛素3天）方案，这种方案分化率也会增高，但我感觉如果2+2（诱导分化液2天+胰岛素2天）可以，还是用2+2的好，3+3有时候培养基会变的相当黄，这两种方案都有文献使用，2+2较多用。
这两种方案我其实都用过，对细胞的影响，我没有看出来本质的不同，但肯定会有不同，只是我不知道。还请前辈指教。

图片附件: 64830517.snap.jpg (2015-10-14 17:20, 34.02 KB) / 该附件被下载次数 23
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=38029

作者: SO2 时间: 2015-10-14 17:20

QUOTE:

原帖由 雪花子 于 2015-10-14 17:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
您说的都到我心坎上了，在于历经艰难之后的那一丝曙光……
为了保证冻存细胞的质量，我一共分了5瓶细胞，然后分别冻存，然后这5瓶细胞我冻存同时各种了一个孔（6孔板），刚好一块板子。因为5瓶细胞的细胞数不尽相同，种皿的时候是约1 ...

应该没有本质影响，早期研究在诱导天数，密度，是否要接触抑制，都有不同的方法，后来逐渐统一到先有growth arrest，再MDI诱导，再Insulin，主要是认为clonal expansion是必须的，至于adipocyte specific gene induction的信号当然更不可缺少了，所以大家关系的一点是第一次诱导insulin是否要加，至于MDI加几天，其实没有多大差别。2天足够了，就很少有人用3天了，3天无非就是MD诱导的那些基因表达时间更长罢了，insulin在这个环节多一天不会有太多作用了。

作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 17:21

功夫不负有心人，现在将第8天分化结果汇报如下，这是未染色前显微镜下观察，可以看见大部分细胞内充满脂滴。个人认为分化效果不错，可以进行实验。
（没有专门到图像室去采图，因为要按小时收费的，而且我的实验不是以分化为目标，所以这个对于发表文章不重要，就直接在细胞房照相了，效果不是很好，供大家参考。）

图片附件: 98955631.snap.jpg (2015-10-14 17:21, 63.8 KB) / 该附件被下载次数 18
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=38030

作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 17:21

油红染色后直接观察，可见均匀的红色。

图片附件: 78362979.snap.jpg (2015-10-14 17:21, 28.93 KB) / 该附件被下载次数 17
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=38031

作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 17:22

这是显微镜下看见的，显微镜效果一般啊，照相技术也很一般，细胞太厚，所以聚焦困难，不论如何，都有不清晰的背景。
对不住，我油红染色的技术不怎么样，感觉细胞固定后有些变形，未染色前镜下看脂滴更丰富，染后的脂滴没那么充满？可能也是视野的不同，但这张图可以代表典型视野，我觉得分化到这种程度，是可以进行实验。如有不同意见，请各位前辈多多指导。
这个帖子得到很多坛友的帮助，在此我谢谢大家了。
在这里尤其感谢思路迪前辈，前辈一直对我的实验很关心，在我最消极和低沉的时候给了我很多鼓励和建议。现在想起来，没有大家的支持，我不知道能不能支撑的过来。这个过程对于我，真的非常有意义，我感觉自己真的坚强了许多。
在此，也祝愿和我一样在研究路上前行的同学，遇到困难坚持住，往前看，不放弃，一定能有解决的方法！！！

图片附件: 61516933.snap.jpg (2015-10-14 17:22, 67.17 KB) / 该附件被下载次数 17
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=38032

作者: ztonyc 时间: 2015-10-14 17:22

见过牛X的帖子，没见过这么牛X的！
最近我做转染效率很低，一般绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白共转，只能看到一种光，而且在蓝光激发下，黑色背景处能看到一个一个小亮点，怀疑是支原体污染，苦无证据！
本想放弃，看到楼主的贴子，忍不住顶了一下！

作者: moonlight 时间: 2015-10-14 17:22

我的细胞也这样，不过我是3T3-E1

作者: okhaha 时间: 2015-10-14 17:23

楼主还在不在？我是楼上的楼上，本来不想验证的，受了楼主的鼓励，决定做一下。
这是我用DAPI染色后的图片，不知道是否是支原体污染，求高人鉴定。

作者: okhaha 时间: 2015-10-14 17:23

不会贴图片，刚才试了一下，不成功，我只有上连接了，大家帮我看看哈！
cuturl('http://bbs.bbioo.com/thread-95937-1-1.html')

作者: xiaoxiaoniao 时间: 2015-10-14 17:23

首先，原则上如果确认支原体污染，就直接放弃，如果是珍贵细胞，比如自己培育的细胞株，或者无法购买的，只能用杀菌剂试试看。
其次，支原体抗生素环丙沙星在临床是有效的，但喹诺酮类抗生素对细胞生长和分化到底有什么影响，我现在也不知道，有市售的专门针对细胞培养支原体污染的抗生素，我记不得厂家了，搜搜就知道，但是价格昂贵，差不多要1000多，所以，还不如买新的3T3L1了。
为了预防支原体污染，能不能预防用药？比如用低浓度的环丙沙星，是否能找个浓度对细胞影响最小？我现在正在做这方面的尝试，但这只是个人经验，不知道可否推广，因为具体情况实在太多的不同，总之，细胞房的环境要保持，然后，操作一定要细致，有结果再来汇报。
......

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M-Plasmocin，可以去除支原体污染，一瓶一千多，但有个好处是处理过的细胞不会再次被支原体污染，如果细胞房环境较差，用的人太多可以考虑用用，毕竟不是每个做实验的人都有实验素养的，我们也基本无法过于约束别人

作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 17:24

不会贴图片，刚才试了一下，不成功，我只有上连接了，大家帮我看看哈！
cuturl('http://bbs.bbioo.com/thread-95937-1-1.html')
我不太确定，因为我们染色剂不同，你用的是PI染色，我用Hoechst染色，这两种染色剂原理并不完全相同，支原体hoechst染色是可以看出来的，但是PI，我没有经验。

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建议查一下染色原理，或者换用Hoechst染色再看看。
还有一个关键问题，染色看是否支原体污染，因为只能人为观察，很多主观因素存在，因此必须有阴性对照，以确定没有污染的图象，再比较之不同。
祝好运。

作者: okhaha 时间: 2015-10-14 17:24

我不太确定，因为我们染色剂不同，你用的是PI染色，我用Hoechst染色，这两种染色剂原理并不完全相同，支原体hoechst染色是可以看出来的，但是PI，我没有经验。
建议查一下染色原理，或者换用Hoechst染色再看看。
还有一个关键问题，染色看是否支原体污染，因为只能人为观察，很多主观因素存在，因此必须有阴性对照，以确定没有污染的图象，再比较之不同。
祝好运。
......

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说得好，我明白了。做个阴性对照。

作者: vera+ 时间: 2015-10-14 17:25

相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征

我最近也在做3T3-L1细胞株的分化，也卡主了，想请教一下师姐，你真的好厉害啊，太坚强了，师姐能否私信一下你的QQ，小弟的63477245，我想Q聊方便些，我最近也很痛苦这个东东。麻烦师姐帮帮忙。。。

作者: xuuuu 时间: 2015-10-14 17:25

我也在做这个，分化不出来啊求教就是按接触抑制2天，诱导I（ibmx，ins，dex）2d，诱导II（ins）2d，后10d都没有看到明显的脂肪粒，有部分变圆了，但没有脂肪粒

作者: 雪花子 时间: 2015-10-14 17:25

目前，我已经毕业，实在是被伤到了，所以以后不再作科研了，估计也不会再养3T3L1，其实，这个细胞我刚拿到手的时候觉得还挺好养的，越到后来越知道难处啊。3T3L1培养和分化可能遇到的问题我只能尽我所知的总结如下：
1，分化不全，分化中细胞飘了；
2，一个假期回来细胞就变了，做不出来了；
3，有时候能分，有时候又不能分，分化率不能总控制的很好，实验重复不好；
这样的情况太多了，我个人觉得和整个实验平台有关。我遇到一个瑞士回来的博后，我跟她谈起我做3T3L1多么艰难的时候，她完全不能理解，觉得怎么会呢？她养3T3L1还能放双休，人家说3，4天换一次液没问题啊，当时我那个憋啊，这人和人差距怎么这么大啊……
废话不多说，在国内养3T3L1我的local建议：
1，首先考虑预算，老板有时候一拍脑袋就要做，他可能并没有细致思考要花那么多大米。
你要给他成本预算，3T3L1细胞株培养分化会比其他细胞基础培养贵很多，强烈建议全部使用protocol上的进口原单产品，例如sigma进口产品。包括常规DMEM，PBS，胰酶，全部要用原配的，而且永远不要随意改配方，用上好就一直用，要不然不知道怎么了，细胞就挂了。列个单子让老板看看，我当时大致算过，常规培养1瓶75cm细胞，每3天消化一次，种板，再分化，循环作业，一个月要数千以上。当然还不包括实验测试部分，比如去做cofocal啦，流式啦，WB等等啊，所以他要没这个底气，直接别做，要不然死定了。
2，如果作，细胞株的购买，我推荐北京协和细胞库，如果能直接从ATCC来当然更好。
如果细胞养着养着不分了，建议直接去协和再买一株，应该800元左右，成本最低的就是直接买。
3，考虑环境问题，我感觉国内细胞培养分化不成的关键问题是污染问题。
包括支原体污染，隐形细菌污染，或许还有重金属污染，液氮里污染更常见。WHO KNOWS???反正一切都不干净！为什么一过暑假细胞就挂啊，夏天，从液氮复苏，培养试剂放了一个假期……我后来都不敢放假，就怕回来不分了，真的很惨啊。
怎么办呢？说实话，不知道。双抗，或者再加上环丙沙星，起码有点保险吧。培养用品多高压灭菌，多消毒，决不重复使用二次。别的，操作就不说了，你要是粗线条的，分装直接拿瓶子倒的那种，那我就建议别作，真的，别作。
这个帖子时不时有人会看，会跟帖，好多同学遇到和我一样的困难，我只能说祝你们好运。要么坚持，要么及早掉头，加油吧。

作者: SO2 时间: 2015-10-14 17:26

楼主，我的细胞分化第3~4天飘起来好多，我离心之后再打回去隔天都死了，看来3T3-L1飘在培养基中不能存活。很桑心，现在一直找原因啊！您能不能给点建议呢？thanks a lot~ 试剂都是进口，严格按照规范操作。。。。

作者: guagua 时间: 2015-10-14 17:26

我已经从协和细胞库拿回来新的细胞株，但观察觉得状态一般，协和老师说这是复苏后第一代，所以可能需要再培养观察一下。
我已经传代，冻存了一些，现在种了小皿，过几天就可以分化，看分化的效果，然后再来告诉大家，只有能分出来，才是好细胞。给大家看看这张图，是协和细胞拿过来传代后第2天的效果，感觉细胞不够丰满，有些细胞轮廓不清，状态一般。
希望和我一样在实验中遇到困难的人坚持到底！给自己打气！

......

==============================================================================================================

在网上查到的，生长良好的细胞，轮廓是不清的。
显微镜观察
生长良好的细胞,在显微镜喜爱可观察到细胞透明度大,折光性强,轮廓不清.相差显微镜观察时可见细胞部分细微结构.若细胞生长状态不良,可见细胞轮廓增强,细胞折光性变弱,细胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质,细胞之间空隙增大,细胞形态不规则,甚至失去原有细胞的特点,产生园缩脱落,有时细胞表面及周围出现丝状絮状物

作者: guagua 时间: 2015-10-14 17:27

呵呵，在我的体系里试剂应该不是问题，首先，我配的试剂曾经顺利分化达1年半之久，其次，我在今年分化出问题时所有试剂又重新配了一遍，都不成，试剂货号，配制方法全都不变。现在怀疑还是细胞出了问题。但出现问题之后，分析起来就是一个黑箱效应，只能从外面猜，看不到里面。现在仍在研究中，但结果未确定，等些时候我会再更新。
另外，协和的细胞不贵，700元一瓶。

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我们实验室的细胞也是从协和买的。
最近实验进展不顺利，开始尝试用3T3L1做实验。
前脂肪细胞一直是用 DMEM低糖+10%CS 养。
细胞种6孔板后，长的很慢，3天了，还没长满，而且还飘了很多细胞。
愁死我了

作者: vera+ 时间: 2015-10-15 11:28

为什么我们做的3T3-L1的分化细胞没什么变化呢还是细长形但是做了油红染色能染上颜色可是就是形状没什么变化啊

作者: eor 时间: 2015-10-15 11:28

我现在也在做这个细胞的分化，好烦人啊。。。

作者: rfv 时间: 2015-10-15 11:29

我现在也在做这个细胞的分化，好烦人啊。。。

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作者: rfv 时间: 2015-10-15 11:30

请问这些是污染吗？

作者: rfv 时间: 2015-10-15 11:31

第一张是3t3-l1 诱导液2 加后第二天染色图片，后面几张是3t3-l1 未分化照片~

作者: ALALA 时间: 2015-10-15 11:31

我觉得在国内做实验真的会经常碰到污染问题。之前在国外Caco2,3T3L1都是随便养，本科生乱养，都好得很。我个人觉得，污染可能一个是空气，另外一个就是操作，包括取液相关的物件。国外基本都是灭菌一次性的塑料移液管，试剂什么的基本都不是自己配的。我们可能就需要降低成本自己配很多东西。去支原体的药虽然一支一千，但是还是很有必要买。分装以后能用恩久。之前3T3也有分化不出来的时候，我做过对比试验，加MDI时候就混了去支原体药，结果分化率提高了一大半，而支原体污染的细胞就根本没有分化出来。

作者: 耗子=== 时间: 2015-10-15 11:31

请问去支原体的药您用的是什么？

作者: seagate 时间: 2015-10-15 11:32

plasmocin 是InvivoGen的

作者: seagate 时间: 2015-10-15 11:32

我的3T3L1就是长的特别乱，然后总是不分化，试剂、细胞都是从一个师姐那里拿的，她刚刚都分化出来了，正常这分别是正常、DYA2、DAY4，后面都没有什么变化了

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作者: biabiade 时间: 2015-10-15 11:33

请教前辈，受到支原体污染的细胞传代消化时会显现什么形态呢？表面光滑外观呈球状或是这张图中显示的形态呢？

图片附件: 93335263.snap.jpg (2015-10-15 11:33, 58.07 KB) / 该附件被下载次数 14
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=38057

作者: qiangren789 时间: 2015-10-15 11:33

请问你分化试剂怎么配制的啊，谢谢大侠

作者: SO2 时间: 2015-10-15 11:33

我也是养脂肪干细胞，不过是人的，也是开头容易后面难，估计也是污染了，但没有去检测。

作者: 65urh 时间: 2015-10-15 11:34

目前，我已经毕业，实在是被伤到了，所以以后不再作科研了，估计也不会再养3T3L1，其实，这个细胞我刚拿到手的时候觉得还挺好养的，越到后来越知道难处啊。3T3L1培养和分化可能遇到的问题我只能尽我所知的总结如下：
1，分化不全，分化中细胞飘了；
2，一个假期回来细胞就变了，做不出来了；
3，有时候能分，有时候又不能分，分化率不能总控制的很好，实验重复不好；
这样的情况太多了，我个人觉得和整个实验平台有关。我遇到一个瑞士回来的博后，我跟她谈起我做3T3L1多么艰难的时候，她完全不能理解，觉得怎么会呢？她养3T3L1还能放双休，人家说3，4天换一次液没问题啊，当时我那个憋啊，这人和人差距怎么这么大啊……
废话不多说，在国内养3T3L1我的local建议：
1，首先考虑预算，老板有时候一拍脑袋就要做，他可能并没有细致思考要花那么多大米。
你要给他成本预算，3T3L1细胞株培养分化会比其他细胞基础培养贵很多，强烈建议全部使用protocol上的进口原单产品，例如sigma进口产品。包括常规DMEM，PBS，胰酶，全部要用原配的，而且永远不要随意改配方，用上好就一直用，要不然不知道怎么了，细胞就挂了。列个单子让老板看看，我当时大致算过，常规培养1瓶75cm细胞，每3天消化一次，种板，再分化，循环作业，一个月要数千以上。当然还不包括实验测试部分，比如去做cofocal啦，流式啦，WB等等啊，所以他要没这个底气，直接别做，要不然死定了。
2，如果作，细胞株的购买，我推荐北京协和细胞库，如果能直接从ATCC来当然更好。
如果细胞养着养着不分了，建议直接去协和再买一株，应该800元左右，成本最低的就是直接买。
3，考虑环境问题，我感觉国内细胞培养分化不成的关键问题是污染问题。
包括支原体污染，隐形细菌污染，或许还有重金属污染，液氮里污染更常见。WHO KNOWS???反正一切都不干净！为什么一过暑假细胞就挂啊，夏天，从液氮复苏，培养试剂放了一个假期……我后来都不敢放假，就怕回来不分了，真的很惨啊。
怎么办呢？说实话，不知道。双抗，或者再加上环丙沙星，起码有点保险吧。培养用品多高压灭菌，多消毒，决不重复使用二次。别的，操作就不说了，你要是粗线条的，分装直接拿瓶子倒的那种，那我就建议别作，真的，别作。
这个帖子时不时有人会看，会跟帖，好多同学遇到和我一样的困难，我只能说祝你们好运。要么坚持，要么及早掉头，加油吧。
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这个细胞号称世上最难养的细胞，，，那真不是盖的。。。

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