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标题: 引物的Tm值计算要不要包括不与模板配对的碱基啊 [打印本页]

作者: mooon 时间: 2011-9-20 13:33 标题: 引物的Tm值计算要不要包括不与模板配对的碱基啊

引物的Tm值计算要不要包括不与模板配对的碱基啊 [转载]

由于在引物的5‘端设计酶切位点，但是这部分碱基不与模板配对，那么在计算引物的Tm值时还要不要把这些碱基考虑在内呢？

作者: blueeye 时间: 2011-9-20 13:33

应该是要的吧

作者: mooon 时间: 2011-9-20 13:36

看了很多关于引物设计方面的文章，但关于这个方面却几乎都没有涉及，所以也就很糊涂了。我要在和模板配对的部分前边加上9个碱基，这些不与模板配对。包不包含这9个碱基，其Tm值相差有将近20度，所以想请教大家，拜托！

作者: babybabe 时间: 2011-9-20 13:37

我不知道你设计的引物有多长，因为引物的长度超过20个bp计算公式就不能利用了。建议你使用软件设计。

作者: @花开花落@ 时间: 2011-9-20 13:37

你可以前五个循环不包括前边的9个碱基，后边的25个循环再加上，但就像楼上说的，引物太长不适用(G+C)*4+(A+T)*2.

作者: zhezhe 时间: 2011-9-20 13:38

我觉得还是要算上哪9个碱基

作者: 喵咪 时间: 2011-9-20 13:38

一般来说5’端飘悬的序列对退火温度的影响是不大的，关键看配对区的TM，在引物设计时只要充分考虑了非配对区对配对区的影响，在计算TM时可不考虑非配对区影响。当然，如果非配对区过长的话就得考虑其错配影响了。

作者: 麻瓜 时间: 2011-9-20 13:39

就我所知是不算的。（实验室的老师同我说的）

作者: @花开花落@ 时间: 2011-9-20 13:39

我所知，不用考虑前面的非配对碱基

作者: 韩梅梅 时间: 2011-9-20 13:40

短于25bp的双链寡核苷酸
Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)
长于25bp的双链寡核苷酸
Tm = 81.5 + 16.6 ( lg[J+] ) + 0.41 (%GC) - (600/N) - 0.63 (%formamide)
N -- 引物的长度(以碱基数计算)
J+ -- 单价阳离子浓度
这样算下来，加不加前面的碱基确实不会差太多。

作者: 微笑的海豚 时间: 2011-9-20 13:40

不算的！

作者: 微笑的海豚 时间: 2011-9-20 13:41

个人意见，开始的十个循环采用配对的TM，以后的二十个采用引物全长的TM-5。这样可以保证特异性扩增特别是对于克隆用的PCR.

作者: 浆果儿cc 时间: 2011-9-20 13:41

开始时PCR反应的主要模板是样品DNA，所以不应该算入；反应后面的循环的模板主要是扩增的产物，会发生配对，所以要考虑，特别是５’端添加碱基很长的话。

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