分析测试百科

标题: 请各位大侠看看我提的RNA，能做RT吗？ [打印本页]

作者: qqq111 时间: 2011-9-20 13:46 标题: 请各位大侠看看我提的RNA，能做RT吗？

请各位大侠看看我提的RNA，能做RT吗？[转载]

各位好
请教一个问题,我提总RNA后，跑琼脂糖电泳，未经变性处理。可是看来似乎不是特别好。请大家帮我看看这RNA，能做RT吗？？特别是6号带，那可是我自己的血分离的单个核细胞啊。
谢谢

图片附件: 41849726.jpg (2011-9-20 13:46, 17.48 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8594

作者: @木木@ 时间: 2011-9-20 13:46

我认为你没有必要跑RNA的电泳你可以用分光光度计检测RNA的含量和纯度再来决定是否能作cDNA及PCR。电泳容易降解RNA。

作者: #甜# 时间: 2011-9-20 13:47

应该能做。不管rna多少都能做。

作者: purrr 时间: 2011-9-20 13:47

可以，做northern不大好，但rt可以，难以保证肯定成功

作者: HOT兔 时间: 2011-9-20 13:48

我认为你没有必要跑RNA的电泳你可以用分光光度计检测RNA的含量和纯度再来决定是否能作cDNA及PCR。电泳容易降解RNA。

-==============================================================================================================

这位仁兄的看法我不赞同。判断RNA质量如何要从以下二点考虑：
1 测含量和 OD260/OD280 判断蛋白是否污染的严重。
2 电泳，我认为这是最重要的指标，一是看28S,18S的比例对不对，二是看RNA有没有降解，三是看DNA污染的情况。
RNA是否可用，要看是什么用途，如果只是为了克隆某个基因，那要求可以低些，以上RNA图可用。如果是为了做半定量PCR或定量PCR，那还是要讲究些。

作者: 大仙 时间: 2011-9-20 13:48

我觉得就新手来说，还是应该跑跑电泳，毕竟RT-PCR涉及多步骤，万一无结果，如果我知道RNA的量和纯度都是好的，电泳也没降解，那么就是逆转录或是PCR体系的问题，这样既可以节省试剂又可以节约时间。至于电泳，虽说按教科书上应作变性电泳，但对像我这样的非专业的“实验员“
，普通琼脂糖的效果就不错，28S与18S的比例还是能看得很清楚，就我的一点经验看，跑电泳时加RNA的量不要太多，时间不要太长，只要都跑出空就可以了。楼主的电泳一定跑了不短的吧，恐怕RNA有降解了吧，还有1，3孔里好像还有东东，是不是DNA污染？不知楼主的RNA纯度怎样，要是没问题的话，我觉得作RT应该是可以的。

作者: coolcool 时间: 2011-9-20 13:49

做是可以的
不过做长片断的rt或者race
上面的图片就不足为据了
建议用分子克隆3的戊二醛电泳
效果比这个好
污染比甲醛变性的小得多
至少不会把人熏死

作者: 菠萝喵 时间: 2011-9-20 13:49

理论上，迹量的RNA都可以得到扩增。从你的电泳图来看，应该可以扩增。而且做RT-PCR前，不需做电泳。用微量紫外分光光度计，可以检测含量和纯度。

作者: 冰激凌小姐 时间: 2011-9-20 13:50

从该图看,28S和18S均清晰,RNA的质量应该是可以的对于提取的RNA一般需要鉴定质量和纯度这是必须的,虽然电泳比较烦琐
1.紫外分光光度计下记录,OD260/280比值,如果在1.6-1.8,说明RNA质量可以,同时可以对RNA定量,知道提取到的RNA量,这对于进行定量分析很重要
2.此外还需要通过电泳鉴定RNA的完整性,分子克隆推荐的方法是1%甲醛变形琼脂糖凝胶电泳,若28S和18S清楚,比值为2:1,则表示RNA完整,降解的RNA电泳中28S和18S条带消失,且主要的片段集中在18S的前方.在这里推荐一种简单的RNA电泳鉴定法,采用0.5*TAE的1%普通琼脂糖电泳(同常规凝胶)在1*TAE电泳液中电泳效果也很好,只要不是做NORTHERN,可以省却许多麻烦,有兴趣的可以试一下
3.在下面的鉴定就是你的RT-PCR了,如果扩增阳性,那就不用担心拉.

作者: 豆荚 时间: 2011-9-20 13:50

在这里推荐一种简单的RNA电泳鉴定法,采用1*TAE的1%普通琼脂糖电泳效果也很好,只要不是做NORTHERN,可以省却许多麻烦,有兴趣的可以试一下

=================================================

胶里什么其他的东西都不加吗？这样不担心RNA会降解吗？请指教。
如果这样真有效果我倒想试一试。

作者: dior 时间: 2011-9-20 13:51

我想你可以考虑一下再次提纯，纯化出纯度高的MRAN，你看呢？

作者: 微笑的海豚 时间: 2011-9-20 13:51

做rt的rna有如下要求:
18S和28S要清晰,且后者比前者亮.我感觉你的rna 不是很好,建议重提

作者: 大虾米 时间: 2011-9-20 13:52

可以做，但你1、3孔好像有大分子物，象DNA。
我觉得你的RNA跑的挺好的。
试试吧。

作者: 橘子水儿 时间: 2011-9-20 13:52

不错，你的实验结果挺好，可以继续。：）
我提了RNA，鉴定也走电泳，1%普通胶，60-70V，10分钟左右观察。降解不明显。

作者: 金手指 时间: 2011-9-20 13:53

我建议不要做电泳的，因为你如果做得是rt-pcr，只需要用紫外分光度计测出rna的质量就可以了，这样决定了是否需要重新提取。。。。。。

作者: join 时间: 2011-9-20 13:53

我认为降解的问题还在其次，在加样孔有DNA带，好像有DNA污染，如果你接下来做RT-PCR的话，就有问题了，到底是RT后的cDNA的扩增，还是基因组DNA的扩增呢？所以有必要加DNA酶处理，消除DNA。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-9-20 13:54

楼上很多同仁已就你的问题提出了宝贵的分析意见和建议,我看了你的RNA电泳图谱,有以下建议,供你参考:
通过你的RNA电泳图谱,可以看出你提的RNA稍有些降解,如果你的试验对RNA要求不高,扩增的基因表达丰度很高,是完全可以用的.
RNA提的好坏,基本标准:OD260/280比值1.8-2.0,2.0质量最高.电泳图谱28S和18S带清楚,比值为2:1,如28S和18S的比值越小,说明RNA的降解程度越大,如28S和18S带消失,则意味着RNA完全降解,一定要弃之勿用,避免浪费.用1%普通胶,120-150v电用即可观察RNA的完整性情况,不一定非得使用1%甲醛变形琼脂糖凝胶电泳.
总之,高质量的RNA(完整性和纯度)是开展与RNA相关研究的前提和基础,一定要提好RNA!

作者: join 时间: 2011-9-20 13:54

上很多同仁已就你的问题提出了宝贵的分析意见和建议,我看了你的RNA电泳图谱,有以下建议,供你参考:
通过你的RNA电泳图谱,可以看出你提的RNA稍有些降解,如果你的试验对RNA要求不高,扩增的基因表达丰度很高,是完全可以用的.
RNA提的好坏,基本标准:OD260/280比值1.8-2.0,2.0质量最高.电泳图谱28S和18S带清楚,比值为2:1,如28S和18S的比值越小,说明RNA的降解程度越大,如28S和18S带消失,则意味着RNA完全降解,一定要弃之勿用,避免浪费.用1%普通胶,120-150v电用即可观察RNA的完整性情况,不一定非得使用1%甲醛变形琼脂糖凝胶电泳.
总之,高质量的RNA(完整性和纯度)是开展与RNA相关研究的前提和基础,一定要提好RNA!

========================================================================

解释的很清楚阿,我们平常提RNA之后也是跑普通胶,但是无论是普通还是变性,电泳肯定是必须的.

作者: 回眸 时间: 2011-9-20 13:55

从该图看,28S和18S均清晰,RNA的质量应该是可以的对于提取的RNA一般需要鉴定质量和纯度这是必须的,虽然电泳比较烦琐
1.紫外分光光度计下记录,OD260/280比值,如果在1.6-1.8,说明RNA质量可以,同时可以对RNA定量,知道提取到的RNA量,这对于进行定量分析很重要
2.此外还需要通过电泳鉴定RNA的完整性,分子克隆推荐的方法是1%甲醛变形琼脂糖凝胶电泳,若28S和18S清楚,比值为2:1,则表示RNA完整,降解的RNA电泳中28S和18S条带消失,且主要的片段集中在18S的前方.在这里推荐一种简单的RNA电泳鉴定法,采用0.5*TAE的1%普通琼脂糖电泳(同常规凝胶)在1*TAE电泳液中电泳效果也很好,只要不是做NORTHERN,可以省却许多麻烦,有兴趣的可以试一下
3.在下面的鉴定就是你的RT-PCR了,如果扩增阳性,那就不用担心拉.

=============================================================

请问您提到的0.5*TAE和1*TAE是什么意思，与跑dna 的TAE有何区别？

另外我最近做RT-PCR碰到的困难是：我早上造大鼠脑缺血模型，过12小时也就是晚上十点左右必须取材，我只能将取下的海马和皮层加入裂解液匀浆后
放到负70度冰箱，第二天早上来提RNA。紫外分光光度计下记录,OD260/280比值,只有1.4-1.5,甚至会出现1.3-1.4。但浓度还行300-500ng/微升。

放在冰箱里是不是有影响，我应该注意些什么。

比值低但是浓度高，提示什么，这样的样本能做RT-PCR吗？

恳请指教！！！

作者: seven7 时间: 2011-9-20 13:56

各位有人认为RNA 18S和28S为1:2才不降解，可能是从书上看的吧，实际操很难达到，并且RNA有物种和组织特异性，有的组织和昆虫的18S和28S并非如此，可能还不是18S和28S。

作者: pou 时间: 2011-9-20 13:56

如果我是你我就不作了。大量DNA污染，有破坏和降解。除非是像看家基因一样好扩的，否则我几乎可以联想您做不出来的情况了。

alphacn

各位有人认为RNA 18S和28S为1:2才不降解，可能是从书上看的吧，实际操很难达到，并且RNA有物种和组织特异性，有的组织和昆虫的18S和28S并非如此，可能还不是18S和28S。

物种差异性我不敢否定，我没有做过，但是提到1:2实在也不是什么难事。如果你比较愿意出钱用Qiagen就行了。呵呵

此外比例不对不一定是RNAase作用的结果，可能是机械破坏而导致。
0票票数

作者: 米米 时间: 2011-9-20 13:57

我想请教rna电泳上样多少微升

作者: 不懂 时间: 2011-9-20 13:57

但你1、3孔好像有大分子物，象DNA

我看象是蛋白多的事

作者: 柠檬籽 时间: 2011-9-20 13:58

我认为你没有必要跑RNA的电泳你可以用分光光度计检测RNA的含量和纯度再来决定是否能作cDNA及PCR。电泳容易降解RNA。

=====================================================================================================

不好意思,我准备做RT-PCR,但是懂得很少,在这里我想问一个很傻的问题:你说电泳容易降解RNA,我不明白跑电泳的样品还能再收回吗?

作者: @木木@ 时间: 2011-9-20 13:58

我也很想知道，跑RNA电泳时，每孔的上样量多少ug合适？

我很长一段时间提取都在做提RNA，RT，可是从来每跑过电泳，因为实验室准备专门跑RNA电泳的东西很麻烦，所以一直每做，很想做！现在在这里看到可以用普通的琼脂糖电泳，很想试试！

有做过的请告诉我，上样量要多少？
是不是也需要和跑DNA一样的Loading Buffer？

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-9-20 13:59

我们实验室一般就用0.7~0.8%琼脂糖电泳，140V，6微升样加2微升左右溴酚兰，结果还不错。

作者: 长发piaopiao 时间: 2011-9-20 13:59

呵呵，我也要准备做RT-PCR，但是什么也不懂。问一个很菜的问题:yingchunhua 说“电泳图谱28S和18S带清楚,比值为2:1”，请问这个比值是指的什么比?

作者: panda王 时间: 2011-9-20 14:00

2:1 means the ratio of the brightness of the two bands (the two strongest ones) each lane.

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)