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标题: 【求助】投稿SCI，修回的建议补实验，请高手指点 [打印本页]

作者: sunbent 时间: 2015-10-19 10:54 标题: 【求助】投稿SCI，修回的建议补实验，请高手指点

投稿修回的意见是这样的：Since the main purpose of this study was to investigate the effect of XXXXXX on thyrocytes proliferation, additional markers for cell proliferation will be required other than MTT assay, which may represent cytotoxic effects of XXXXXX.文章没有发，不能把干预药物说出来，用XXXXXX代替，请诸位谅解。
我想请教各位，我做的是MTT和CCK-8研究增殖的，因为MTT和CCK-8的趋势完全一致，所以就只写了MTT，除了MTT和CCK-8，还有什么更好的方法做增殖么？
拜托大家帮忙，文章要求11月1号之前修回，急死我了

作者: bojitu 时间: 2015-10-19 10:55

BrdU？

作者: vera+ 时间: 2015-10-19 10:55

BrdU或者3H-thymidine incorporation assay. 前者简单些，就是试剂盒稍贵，后者用到放射性检测，需要特殊实验室。这两个assay才是真正看细胞的proliferation 而不是viability。你用的MTT或者CCK-8其实看得是细胞的viability，或者就是药物的cytotoxicity.

作者: cocacola 时间: 2015-10-19 10:55

QUOTE:

原帖由 vera+ 于 2015-10-19 10:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

BrdU或者3H-thymidine incorporation assay. 前者简单些，就是试剂盒稍贵，后者用到放射性检测，需要特殊实验室。这两个assay才是真正看细胞的proliferation 而不是viability。你用的MTT或者CCK-8其实看得是细胞的viabil ...

我也一直在找cell proliferation, cell cytotoxicity, cell vialbility 检测方法的异同。

作者: sunbent 时间: 2015-10-19 10:56

看来只能做Brdu了，试剂盒比较贵，要5000左右吧，我想做Brdu-ELISA方法的，免疫荧光的不好量化；另外我打算做细胞计数；谢谢楼上的各位

作者: seagate 时间: 2015-10-19 10:56

也可以用EdU，不知道你做多少样？
EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替T渗入正在复制的DNA分子，通过基于EdU与Apollo®荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性，通过检测EdU标记便能准确地反映细胞的增殖情况。与BrdU检测方法相比，EdU检测方法更快速、更灵敏、更准确。EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等）即可有效检测，可有效避免样品损伤，在细胞和组织水平能更准确地反映细胞增殖等现象。

作者: ero11 时间: 2015-10-19 10:56

用MTS或者wst-8，你自己查查有卖吗，你们这里，方便安全的东西啊，呵呵

作者: woshi 时间: 2015-10-19 10:57

除了BrdU以外，还可以通过流式检测细胞增殖，因为MTT和CCK8是很粗略的增殖研究手段，目前似乎SCI已经不承认了，必须进一步实验验证。
除了上述以外，还应该做一些蛋白，比如cyclin和激酶，及一些相关的因子检测，这样会更充分些。
祝，成功。

作者: ladyhuahua 时间: 2015-10-19 10:57

CFSE染色，流式检测也可以反映细胞增殖。

作者: ALALA 时间: 2015-10-19 10:57

最好流式细胞仪检测，上述有些方法真的已经很古老了

作者: greenbee 时间: 2015-10-19 10:57

正如前述，MTT和CCK-8属于细胞毒性实验（ cell viability），而非检测增殖的最佳方法。LZ可考虑做各处理组细胞数量（Beckman的cell counting）和增殖Marker的表达情况，如PCNA。

作者: yayya 时间: 2015-10-19 10:58

我也建议做流式

作者: summerxx 时间: 2015-10-19 10:58

在检测细胞毒性方面，MTT或者CCK8只需选择其中一种就可以了。
reviewer是希望楼主从不同的方面评价该药物对细胞proliferation的影响，建议完成一下实验：
1、克隆形成试验
2、细胞周期评价，观察G0/G1期、S期比例变化
3、细胞增殖标记：如PCNA或Ki67等。

作者: vcve 时间: 2015-10-19 10:58

QUOTE:

原帖由 summerxx 于 2015-10-19 10:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

在检测细胞毒性方面，MTT或者CCK8只需选择其中一种就可以了。
reviewer是希望楼主从不同的方面评价该药物对细胞proliferation的影响，建议完成一下实验：
1、克隆形成试验
2、细胞周期评价，观察G0/G1期、S期比例变化
3、细 ...

这个很到位，如果都做了， reviewer肯定无话可说了。

作者: panda王 时间: 2015-10-19 10:59

如果想发SCI的文章，MTT方法太古老了，不易采用。检测细胞增殖最经典也是目前公认的方法就是3H掺入法，但是此法有放射性，已有被流式细胞术检测细胞增殖所取代的趋势。如果你想发表SCI的文章，最为理想的就是采用流式细胞术的方法。
流式细胞术检测细胞增殖主要有3种方法：直接计数法、CFSE标计法和Brdu标记法，其中Brdu标记法常用于体内检测，体外检测很少用到，不建议采用此法。你可以使用直接计数法和CFSE标记法，两种方法同时使用。
直接计数法很简单，就是利用流式细胞仪直接计数增殖后的细胞数目。CFSE标记法，需要购买CFSE染料。

作者: 红袖添香 时间: 2015-10-19 10:59

最便宜的方法是进行1周的细胞生长曲线实验，现许多文章多用这一方法。

作者: Darcy 时间: 2015-10-19 10:59

1、我本人是很不赞成使用Brdu进行体外细胞增殖，该方法主要是用以体内研究，其外研究不可取，尤其是“SCI杂志”；
2、MTT或CCK8法选其一即可，且这两种方法被国内外学者广泛认可，即使是10分20分的文章，也是使用这两种方法，一点也不古老。
3、最关键一点，我想再次重申，reviewer是希望从不同的角度，选用一些marker来评价药物对细胞增殖的影响，而不是让你用不同的方法去测增殖，请注意，是不同的“角度”。为什么建议做流式，是因为流式可以评价是否细胞被阻断于G0/G1期，是否S期比例下调。Ki67或者PCNA是属于核分裂抗原，可评价DNA合成与分裂程度。
4、当然，也可以选择一些细胞周期蛋白（如Cyclins等），跑些western，这些都是很有帮助，但如果只去检测一两个如cyclinD1分子很难使人信服，应该多选择几个，反正一起跑就是。
5、还有一点很重要，怎样补实验，还要取决于你所投的杂志档次，三分一下稍加补一下即可，若是4、5分及以上，还是要认真、认真、再认真对待。

作者: NBA 时间: 2015-10-19 11:00

要不是中文论坛，我都以为这是我review的稿子，前段时间刚审了一个韩国人的稿子，给了类似的意见，作者用MTT来分析细胞cytoxicity，我要求作者用其它的手段检测。
因为正如楼上有坛友说的那样，MTT和CCK-8一样，反应的是增殖和凋亡的平衡结果，严格来说，并不能用来单独反应增殖或者凋亡。你的文章里，reviewer的意见也是基于这个道理。常有人把MTT当作研究增殖的方法，其实是不严谨的，MTT应该是增殖/毒性测试方法。很多公司卖MTT时宣传是增殖分析kit，也是不对的，这个必须在细胞没有死亡的前提下才能确认。
现在常用的反应增殖的方法，楼上不少坛友说的非常好，就体外培养的细胞来说，主要有：在细胞水平（Brdu掺入分析，反应S期的增殖；phospho H3，反应M期），分子水平（WB检测一些周期蛋白的表达，比如Rb的磷酸化，cdk蛋白的磷酸化，Cyclin蛋白的表达，PCNA的变化，主要检测G1/S transition阶段作用的蛋白）；体内常用Ki67和phospho H3，brdu法。
楼上有人回帖说用PI单染，FACS检测S期变化，这里提醒大家，这个方法用于增殖分析是不严谨的。因为这样的PI单染FACS只能检测出各周期含量，如果S期多了，可能是S阻滞导致，也可能是S期合成增多导致，FACS图上是看不出来的。如果是基于cyclin标记的FACS，当然可以看出来。还有坛友提到克隆集落形成实验，也是要小心的，这个实验是经典的survival/cytoxicity assay，千万不要当作增殖分析来做，不然会被一些脾气不好的reviewer以研究细胞增殖却犯常识性错误而锯掉文章的。
另外，在论坛上常看到有人说某种方法过时，其实对研究者来说，只要方法能辅政结论，无所谓过时，有些方法不再用了，是因为之前有各种各的样缺陷，现在找到更好的办法，就不常用了，比如H3标记测细胞增殖，因为现在有了很好的brdu的抗体，brdu标记非常简单，所以很少有人用了。这个方法的过时，不是因为方法的质量有问题，而是因为操作不方便。但你要用这个方法，reviewer是不会质疑的。当然有些方法是因为当初不严谨，没有出现更好的方法之前大家迫不得已用，后来自然抛弃了，但这样的方法其实不多，多半都是当时不知道，后来发现有缺陷，于是很快就抛弃了。
另外，几个个人观点供大家参考：
1，免疫荧光染色Brdu可以量化，主要镜下数Brdu positive数目，一般数500个细胞；或者FACS统计阳性比例，但显然后者耗钱很多，一般镜下就可以了。
2，Brdu并不是主要用于体内，体外研究也大量使用。体内多见，是因为很多体外方法体内不能用，而brdu体外体内都能用。
3，所谓的SCI文章，从来不会因为一个方法比较古老，而否定一个数据，至少我们review文章的时候从来不用这个原则，考虑的只是这个方法能否回答这个问题，是否有缺陷，而不会去考虑这个方法的新旧，是否用得比较多（用得多的不一定说明问题，用得少的不一定质量有缺陷，MTT和H3标记分别是两个很好的例子）。我也没有听过其它人review文章用这个原则：）
4，高分和低分的SCI文章，主要差别在于结论的意义重要性，少数在于结论的可靠性（一些重大结论的方法是否能说明这个结论），而不是方法本身的fancy，所以即使是review低分的SCI（比如3，4分的），我们也会对方法要求比较严，开头提到的一片文章，就是一个4分的文章，但我仍然要求他补做一些实验。当然，如果结论比较重要，有的时候低分文章，对方法不会很苛求，因为很多方法很难做，要真做出来了，也不会投这个杂志了。但常规的方法，是不再这个例外考虑之内的。
2 cents，希望对大家有所帮助。

作者: sunbent 时间: 2015-10-19 11:00

楼上老师，我就是投稿的韩国杂志ARPR，不会真是您给审稿的吧

作者: sunbent 时间: 2015-10-19 11:01

今天文章终于接受了，感谢楼上各位的帮助，我是做的EDU检测增殖，流式检测细胞周期，WB做的cyclinD1和cyclinB1

作者: iii_ii 时间: 2015-10-19 11:01

我看了大家的回帖，也在考虑用什么指标反映增殖又经济又能反映问题
请问楼上提到过的 CFSE染色这个指标到底怎么样啊

作者: join 时间: 2015-10-19 11:01

检测药物刺激细胞后的存活，用CFSE上流式的效果有谁做过吗？请各位指教...

作者: eor 时间: 2015-10-19 11:14

感觉可以补一个流式，标记CD3,CD4,CD8,看CD4/CD8

作者: yayya 时间: 2015-10-19 11:49

如果大家在做BrdU做不出来，不妨用用EdU，确实是一个不错的方法。
很好做，结果也很清晰，主要的是节省我们宝贵的时间。
我用的是锐博生物的EdU细胞增殖检测试剂盒，1周就做完了。

作者: caihong 时间: 2015-10-19 11:51

这么多方法，我主要选择哪一个呢，纠结。我想测细胞增殖，腭突上皮细胞的。

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