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标题: 【求助】puromycin 筛选浓度 [打印本页]

作者: sunbent 时间: 2015-10-20 10:34 标题: 【求助】puromycin 筛选浓度

相关疾病：
结肠癌

各位老师
我现在用构建shRNA干扰载体，慢病毒包装，感染结肠癌细胞株，puromycin 筛选稳定感染的细胞（载体没GFP基因），想请问各位老师，感染后多长时间加药？你们筛选的浓度是多少？筛选多长时间？谢谢！

作者: lorri 时间: 2015-10-20 10:35

QUOTE:

原帖由 sunbent 于 2015-10-20 10:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

相关疾病：
结肠癌

各位老师
我现在用构建shRNA干扰载体，慢病毒包装，感染结肠癌细胞株，puromycin 筛选稳定感染的细胞（载体没GFP基因），想请问各位老师，感染后多长时间加药？你们筛选的浓度是多少？筛选多长时间？谢谢！ ...

你好，最近我也在做puromycin 筛选稳定感染的细胞株的预实验，请问你筛出来的浓度是多少？筛的时间是多长呢？

作者: sunbent 时间: 2015-10-20 10:35 标题: 回复 #2 lorri 的帖子

我还没开始筛呢。。。呵呵

作者: idea2011 时间: 2015-10-20 10:35

怎么样，我也要做。也是没有GFP的，请问你们怎么做的，能联系你嘛？

作者: iii_ii 时间: 2015-10-20 10:36

有人做了吗？推荐下致死时间和浓度吧。分享、分享！！

作者: okhaha 时间: 2015-10-20 10:36

都没有答案呀，看样子还是得自己老老实实的做杀伤曲线确定了。

作者: idea2011 时间: 2015-10-20 10:36

2.5ug/ml 0.5ug/ml 不等~

作者: sunbent 时间: 2015-10-20 10:37

相关疾病：
puro毒性挺大，1ug/ml 肠癌细胞24h就死完了，感染72h后，直接加2ug/ml puro筛选克隆应该没问题，我筛选到5ug/ml细胞都能活着好好的。

作者: iii_ii 时间: 2015-10-20 10:37

我也在做这个的筛选试验，是在肝癌细胞系上。但我的0.5ug/ml的浓度，细胞可以活，但是一直长不起来，都5天了，还是稀稀疏疏的。

作者: idea2011 时间: 2015-10-20 10:39

最近也在做puro筛选，不知道加药晒讯多长时间合适？有没有前辈可以指导一下？

作者: yonger 时间: 2015-10-20 10:39

QUOTE:

原帖由 idea2011 于 2015-10-20 10:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
最近也在做puro筛选，不知道加药晒讯多长时间合适？有没有前辈可以指导一下？

浓度梯度做了吗
一般24h-48未感染细胞可以死光
这个时候已经可以用了
可以传代再筛一次即可

作者: cocacola 时间: 2015-10-20 10:39

做过浓度梯度了，不知道如果筛选时间过长会有何影响？

作者: ujne 时间: 2015-10-20 10:40

先做浓度梯度，72h几乎死光的药物浓度就可以。
正式实验时，同时设立Blank加药组，通常慢病毒侵染72h即可加药，待到Blank加药组死光，再压个2、3天，然后药物浓度降至原来的一半，持续加药，稳转株就算是筛出来了。

作者: bojitu 时间: 2015-10-20 10:40

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先天性卵巢发育不全综合征
我也在做，请教了一些专家，收集病毒颗粒用0.45um滤膜过滤后，直接替换待感染培养基，同时加polybrene 6-8ug/ml左右，感染24h后用新鲜的培养基替换，同时加puro筛选，大约在2-3天内空白细胞全部死亡的浓度，待空白细胞全部死亡后，可停止puro，细胞生长传代，最好筛选三代。

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