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标题: 如何提高PCR的扩增效率？我的模板量很小 [打印本页]

作者: 911 时间: 2011-9-20 16:44 标题: 如何提高PCR的扩增效率？我的模板量很小

如何提高PCR的扩增效率？我的模板量很小

如题。请高手指点！

作者: +田田+ 时间: 2011-9-20 16:45

你可以换上TAKARA或QIAGENE的酶试试,还有就是做一个Mg2+浓度梯度,看看在什么浓度它的扩增效率最高,还有就是你样品的纯度了,纯度高扩增效率应该有所改善,如果序列很短你就用两步PCR咯,这是我的浅见,但愿有用

作者: 喵咪 时间: 2011-9-20 16:45

你可以用巢式PCR进行扩增，可以在一定程度上提高PCR的效率，并且效果还是比较明显的。当然你可以试一试先用随机引物做一个预扩增，然后将预扩增产物用做模板再用你的引物进行扩增，我想如果你要扩增的片段不是很大的话，应该也是有效的。

作者: 不懂 时间: 2011-9-20 16:47

nestde PCR

作者: +田田+ 时间: 2011-9-20 16:48

可以加大dNTP浓度，在不影响扩增的条件下，适当降低退火温度。一般能解决，当然稍微加大酶量也是起作用的。

作者: 8黑眼圈8 时间: 2011-9-20 16:48

如果模板量很少，可以用PCR产物做模板，再次扩增后切胶纯化。

作者: #甜# 时间: 2011-9-20 16:48

你是否知道你的片段大小？如果知道，就比较简单！ｐｃｒ结束后，电泳时，你用ｐｃｒ产物和ｍａｒｋｅｒ作比较，找出目的片段，切胶后，不必像楼上所说的取纯化，直接浸泡到５０ｕｌＴＥ里，过一两天，这些溶液就可以做模板

作者: PINK 时间: 2011-9-20 16:49

有了足够量的模板，可以作优化，用软件设计优化实验方案，很快就能找到最佳的Ｍｇ２＋等各项参数的最佳值，提高PCR的扩增效率！

作者: 911 时间: 2011-9-20 16:50

谢谢大家的意见！我想我写的太笼统了！我是用两对引物进行巢式扩增，由于扩增的序列含量很小，所以第一次扩增是看不到电泳条带的（文献中就是这样，我做的也基本上是这样），第二次扩增有一条300bp左右的条带。我的阳性对照已经有了，也很稳定，条带也很强，但是实验的模板量却很少，看到这个版里面前人的经验，我把两轮引物浓度都已经调到最低了，最后能够得到一个阳性条带，但是比较弱－－比引物二聚体弱，当然引物二聚体是偏强的那种。我第一轮产物是500bp左右，我是用的都30s，复性温度60，是根据文献来的，第二轮我把延伸温度改从30s改成了18s。看到大家建议我降低复性温度，我不知道有没有效果。因为我感觉我主要的问题似乎是引物二聚体。谢谢大家的帮助！

作者: 雪花子 时间: 2011-9-20 16:51

有了足够量的模板，可以作优化，用软件设计优化实验方案，很快就能找到最佳的Ｍｇ２＋等各项参数的最佳值，提高PCR的扩增效率！

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用什么软件设计优化方案啊？

作者: 椰子叶子 时间: 2011-9-20 16:51

这方面的软件很多，比如正交设计、均匀设计软件等

你找不到的话联系我

这是个三水平的正交设计软件 cuturl('http://nj.onlinedown.net/soft/17780.htm')

作者: 笔笔 时间: 2011-9-20 16:52

我也对这些个软件有兴趣，这样可以减少很多实验的过程啊！顶！

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