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标题: mRNA直接PCR能扩增出产物吗？ [打印本页]

作者: 月牙牙 时间: 2011-9-20 16:55 标题: mRNA直接PCR能扩增出产物吗？

mRNA直接PCR能扩增出产物吗？ [转载]

如题：mRNA不经反转录而直接PCR从理论上似乎行的通！
可是实践中能成功么？愿闻君高见！

作者: 韩梅梅 时间: 2011-9-20 16:55

首先告诉你一个铁的实事，就是mRNA不经反转录而直接PCR无论从理论上还是实践中都绝对不行的。说句你不爱听的话，你这么说只能说明一点：就是你的生化和分子生物学知识还没弄懂。建议你找本书看看，先把理论懂，免得将来走弯路。
这里简单告诉你一个流程，就是mRNA必需经RT-PCR得到cDNA后才能PCR。

作者: 喵咪 时间: 2011-9-20 16:55

不可以，如果你的经费不足的话，可以用总RNA直接反转录，再做PCR。这样的条件刚做过，只是在加总RNA时量要增加，效果还不错，我的结果已送去测序。

作者: 春雨 时间: 2011-9-20 16:56

Taq 酶是DNA polymerase，是以DNA 为模版的 DNA polymerase。（反转录酶是以RNA 为模板的 DNA polymerase）

虽然写出来RNA 与 DNA 差得不多，但RNA 的五碳糖上是有-OH的，而DNA 的糖上是 -H，所以DNA 又叫脱氧核糖核酸。

作者: #甜# 时间: 2011-9-20 16:57

这很有意思。从RNA到DNA是质变，而PCR过程只是量变，这里面必须要有一个因素来使之达到飞跃，就是逆转录酶。要知道PCR反应中的DNA聚合酶是只认得DNA模板的，没有RT过程提供第一条DNA，扩增无从谈起。你要是想在PCR过程中用一个只认得RNA模板的DNA聚合酶，那也有问题，因为总是只有母体的一条RNA做模板，无法形成双链，也没有办法大量扩增。除非找到一个同时认得RNA模板和DNA模板的聚合酶（当然还得符合PCR过程的苛刻条件），但这个过程如果聚合酶以RNA为模板合成了DNA, 其实也还是一个质变的问题，就是逆转录。

作者: 阿福 时间: 2011-9-20 16:57

这个问题很有趣,因为最近我遇到这样的情况,也在思考中
我在测试一对引物时,设置共四个反应,1和2是两个不同个体的cDNA,3是一个个体的总RNA但是在和1,2一同逆转录时未加逆转录酶,也就是说3这个标本不含cDNA,只有RNA,4是阴性对照(用H2O),结果,1,2为阳性,4为阴性,这和预期一样,奇怪的是3也是阳性,在电泳图中可以清晰看到和1,2大小相同的PCR产物,只是比前两者的量低(且实验过程中肯定没有污染),为此特地买了RNase,将3标本用RNase消化后,继续重复上述PCR,结果,3的条带消失了.所以本人以为mRNA也有直接被扩增的可能,但是从理论上讲THIS IS MISSION IMPOSSIBLE
不过可惜的是我没有将那个扩增产物进行测序,否则则更加结果明确.
不知道是否楼上XDJM中有人也对未加逆转录酶的RNA直接做过PCR扩增?

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-9-20 16:58

所以本人以为mRNA也有直接被扩增的可能,但是从理论上讲THIS IS MISSION IMPOSSIBLE

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这个小实验挺有意思。不过结论还没有听说过排除了DNA污染，能否就你的实验排除有逆转录酶污染呢？如果不能，那做这个结论是否有点早。呵呵，讨论讨论

作者: 微笑的海豚 时间: 2011-9-20 16:58

“兄弟的实验设计不够严谨^_^。

估计导致3是阳性的原因是存在genomic DNA污染，这在total RNA中很常见，祛除污染可以用RNase free的DNase处理。设计RT引物时最好考虑跨内含子，以此来区分污染引起的条带。

作者: 阿福 时间: 2011-9-20 16:59

设计的引物是在不同的外显子区域,所以如果扩增的是GENOMIC DNA则其片段长度必然远远大于目前的长度(包含内含子),而且内含子有10K以上,基本无法扩增出产物
其次逆转录酶污染也可以排除,而且如果有污染而合成了cDNA,那用RNase处理后应该依旧有扩增条带,而现在没有
所以说结果非常奇怪,到底这个PCR模板哪里来的
请大家讨论讨论,非常有趣

作者: 胖小妮子 时间: 2011-9-20 16:59

又在网上找了一下，好象没有提出RNA可以做 DNA polymerase 扩增模板的说法。我们看来还是要在污染上找一下原因了。

如果你的的RNase 有少少量DNase 污染呢？

作者: 阿福 时间: 2011-9-20 16:59

问题
同一个-cDNA在一些引物对时无扩增现象而在某些引物对是有扩增现象。
所有引物设计都是符合上游和下游引物分别位于不同外显子，这样可以确保不会扩增Genomic DNA。
而如果有逆转录酶的少少量污染，那么对于所有引物对，一般都应该有扩增产物，而我做GAPDH或CYCLOPHILIN时，-cDNA结果是阴性的，这说明其中不含cDNA。因此不是含有DNase消化了可能污染的cDNA而使结果变阴性的。
所以还是觉得奇怪。
但是我看到一篇文献似乎提到这种可能，可是作者未写明，只是DATA NOT SHOWN，我准备发EMAIL再详细问一下。
不过希望大家对此讨论或者哪个有条件可以做一下看看。
如有兴趣我可以提供引物序列。

作者: 椰子叶子 时间: 2011-9-20 17:00

怀疑是个好习惯，但作了假设后就要仔细求证^_^

跨内含子设计的引物依然可能从genomic DNA中扩增出与cDNA为模板大小相仿的带来。假基因（pseudogene）的存在就是原因之一。注意，假基因可以不含内含子的。概念见：cuturl('http://binfo.ym.edu.tw/post/genome/pseudo_gene.htm')

正确的做法是用RNase free的DNase处理总RNA, 设立处理与未处理、加RT 酶与不加RT酶的对照实验。

实验应当具有可重复性，若仅仅是偶然的结果，就不能轻下结论^_^

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-9-20 17:00

这很有意思。从RNA到DNA是质变，而PCR过程只是量变，这里面必须要有一个因素来使之达到飞跃，就是逆转录酶。要知道PCR反应中的DNA聚合酶是只认得DNA模板的，没有RT过程提供第一条DNA，扩增无从谈起。你要是想在PCR过程中用一个只认得RNA模板的DNA聚合酶，那也有问题，因为总是只有母体的一条RNA做模板，无法形成双链，也没有办法大量扩增。除非找到一个同时认得RNA模板和DNA模板的聚合酶（当然还得符合PCR过程的苛刻条件），但这个过程如果聚合酶以RNA为模板合成了DNA, 其实也还是一个质变的问题，就是逆转录。

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Tth DNA Polymerase 在Mn 2+存在时显示RTase活性。但此酶合成的cDNA平均长度只1-2Kb，而且催化反应的最适温度较高，不合适用oligo(dT)或random Primer，Mn 2+的存在也会降低DNA合成的保真度。

作者: 岸上的鱼 时间: 2011-9-20 17:01

我好像看过国外的一个文献，TAQ酶也具有逆转录酶样作用，但是将RNA直接放入PCR体系中进行PCR的实验我没做过，如果按照RT-PCR两步法条件，全部用taq酶完成，说不定可以出带，方便的同仁可试试。

作者: 阿福 时间: 2011-9-20 17:02

楼上的两位兄弟或者哪位XDJM能找到这些文献吗，我想看看，近来对此问题觉得非常有趣。
此外：piscean wrote
Tth DNA Polymerase 在Mn 2+存在时显示RTase活性。但此酶合成的cDNA平均长度只1-2Kb，而且催化反应的最适温度较高，不合适用oligo(dT)或random Primer
虽然oligo(dT)或random Primer不适合，但是据说提RNA时混合一些小片段的DNA，他们仍然可能作为引物的。而且1-2kb长度足够可以作为PCR模板，因为我的PCR产物才100bp上下
对于TAQ这是最常用的酶

作者: 微笑的海豚 时间: 2011-9-20 17:02

此外：piscean wrote
Tth DNA Polymerase 在Mn 2+存在时显示RTase活性。但此酶合成的cDNA平均长度只1-2Kb，而且催化反应的最适温度较高，不合适用oligo(dT)或random Primer
虽然oligo(dT)或random Primer不适合，但是据说提RNA时混合一些小片段的DNA，他们仍然可能作为引物的。而且1-2kb长度足够可以作为PCR模板，因为我的PCR产物才100bp上下
对于TAQ这是最常用的酶

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Tth DNA Polymerase并非Taq，而且其RTase活性也只有在Mn 2+而非Mg 2+存在时才能得已表现，而之所以说不合适用oligo(dT)或random Primer是因为Tth 要求的温度较高，不利于这类引物的退火，当然如果你并不想要全长cDNA或你的目的片断较小的话可以考虑用Tth，尤其是作定量RT-PCR的话减少中间步骤还可以使结果更可靠!但你可能要设计较高Tm值的引物。还有一个问题，Mn 2+存在时Tth的保真度很低。

作者: 阿福 时间: 2011-9-20 17:02

EVIDENCES
找到相关文献,Taq Polymerase在68度左右确实具有RTase活性
下面是文献,请大家继续探讨
1.Nucleic Acids Res. 1989 Oct 25;17(20):8387-8.
Reverse transcription of mRNA by Thermus aquaticus DNA polymerase.
Jones MD, Foulkes NS.
网上无全文摘要,请自查原文期刊,或者求助管藏
2.J Biochemistry and Mol Biol 2002; 35(2):248-250
A simple method for elimination of false positive results in RT-PCR.
Martel F, Grundemann D, Schomig E.
关于Tth和Mn离子有关,也有文献
Biochemistry 1991. 30(31):7661-6
Reserse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase.
Myers TW and Gelfand DH.

作者: 花裙子 时间: 2011-9-20 17:03

不可以，如果你的经费不足的话，可以用总RNA直接反转录，再做PCR。这样的条件刚做过，只是在加总RNA时量要增加，效果还不错，我的结果已送去测序。

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问一句，您的意思，如果经费足的话，可以如何做？

请指点

作者: 小荷尖尖 时间: 2011-9-20 17:03

PCR是用双链做模板的，这个是不变的基本原理。直接用单链RNA是不能做PCR的，必须要转录成双链。 RT-PCR也是要合成了双链DNA之后才能PCR的。看看这个RT-PCR的图解就知道了。

图片附件: pp-pcr1.gif (2011-9-20 17:04, 12.07 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8595

作者: 小荷尖尖 时间: 2011-9-20 17:04

RT之后再用Taq做PCR

图片附件: pp-pcr2.gif (2011-9-20 17:04, 8.81 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8596

作者: 椰子叶子 时间: 2011-9-20 17:05

我觉得PCRFAN的图表很直观，经典的传统理论是如此，不过我认为楼主想法值得进行讨论，breakthrough往往是在逆境中浮出水面的，虽然此看似不可能，也许会引出其他的意外，有一百个人，当99个人反对你时，也许真理会在你手中！

作者: 庄梦蝶 时间: 2011-9-20 17:05

taq酶有一定的逆转录能力，但效率差，一般不用！特别是逆转录不贵的情况没有必要用！

作者: 不懂 时间: 2011-9-20 17:05

1、Methods Enzymol. 1993; 218: 413-9.
Reverse transcription of mRNA by Thermus aquaticus DNA polymerase followed by polymerase chain reaction amplification.
Jones MD.

2、Anal Biochem. 1990 Nov 1; 190(2): 292-6. Related Articles
Amplification, detection, and automated sequencing of gibbon interleukin-2 mRNA by Thermus aquaticus DNA polymerase reverse transcription and polymerase chain reaction.
Shaffer AL, Wojnar W, Nelson W.

Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) is a gene expression assay by which messenger RNA (mRNA) production can be measured. This technique involves three steps: isolation of RNA from cells or tissues, the creation of a DNA copy of the desired message (cDNA) by viral reverse transcriptase enzymes (RT), and amplification of this DNA segment by the polymerase chain reaction (PCR) for subsequent quantitation and analysis. Here we describe a one-enzyme, one-step method combining the RT and PCR steps of conventional RT-PCR by exploiting the recently documented RT properties of Taq polymerase, the thermostable enzyme used for PCR amplification of DNA. ......

作者: 绿茶公子 时间: 2011-9-20 17:06

澄清了我心中的一个疑问,这样抛砖引玉的讨论很有价值8D

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