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标题: DPPH又是用无水乙醇配的，正常情况下是会沉淀的吧？？？ [打印本页]

作者: 倾尽温柔 时间: 2015-10-21 09:12 标题: DPPH又是用无水乙醇配的，正常情况下是会沉淀的吧？？？

今天做了多糖抗氧化测DPPH的实验，问题很多：
1、DPPH用无水乙醇溶的，然后实验出现了絮状沉淀。
2、空白组吸光度超过了1。
3、加了多糖样液的部分样品吸光度超过了空白。

多糖制备的时候是用醇沉的，多糖不溶于醇，DPPH又是用无水乙醇配的，正常情况下是会沉淀的吧？？？有没有办法解决这些问题呢？？？求教大神们了，很急啊！！

作者: 舞疯 时间: 2015-10-21 09:12

我也有用DPPH自由基来测样品的抗氧化能力，浓度为0.1mM的DPPH无水乙醇溶液在517nm下吸光度是0.9以上，所以不加抗氧化剂的空白对照中DPPH的浓度为0.1mM较好。我是用0.2mM的DPPH溶液和待测样品同体积混合。针对你的问题：1 出现絮状物应该是溶解问题：可能你的糖提取液跟DPPH溶液不能混溶，也可能反应产物不能很好溶解，还可能。。。；2 浓度为0.1mM的DPPH无水乙醇溶液在517nm下吸光度由于仪器、参比等客观条件也可能会大于1，我实验数据也有稍大于1的；3吸光度大于空白，可能是因为你体系形成的絮状物造成的干扰，原则下，分光光度法要求待测液是溶液（也就是要澄清透明的）。希望对你有帮助。

作者: 翔少爷 时间: 2015-10-21 09:16

你的样品是用醇沉的，所以我觉得你可能不适合用DPPH这个方法测量，因为DPPH要么用甲醇溶解要么用乙醇溶解来制备，不知道你换成甲醇还会不会出现这个问题。考虑乳化剂是一个解决的办法，我见过的有SDS的，环状糊精的，也有你说的DMSO的，如果还用分光，波光应该还是原来的波长，因为原理是没变的，不放心的话，做个波长扫描就行了，很方便的；另外，你可以考虑看能不能更换样品的溶剂，比如丙酮。如果都不行的话，可以考虑换方法啊，测清除自由基能力的方法很多的，不一定局限于这一种。

作者: 小米粒 时间: 2015-10-21 09:20

DPPH浓度是0.2mM，感觉应该用0.1mM的
多糖是粗品，不过感觉吸光度反而大了是由于产生了沉淀
不知道是不是这样呢？？

作者: 星星…… 时间: 2015-10-21 09:23

不知道你是不是要用vc做标曲，如果你这三个浓度的清除率都是90%多，那说明较低浓度的VC的时候基本就把自由基清除差不多了，所以你可以考虑把浓度继续稀释，具体浓度，你试吧。

作者: kaixinjiuhao 时间: 2015-10-21 09:28

絮状沉淀应该是多糖吧，多糖不是水提醇沉么呵呵，空白组超过1，是不是因为你dpph浓度过高呢？加了样品的吸光度超过空白？那可能是你多糖不纯的，是不是里面参杂了别的色素之类东西呢......

作者: 美丽婷婷 时间: 2015-10-21 09:32

我也遇到过这事由于糖浓度过高的原因，你把浓度降低就ok啦

作者: 双_视野 时间: 2015-10-21 09:35

糖浓度过高吧，浆浓度降低即可。

作者: 莫莫莫 时间: 2015-10-21 09:37

打算降低浓度做不过实验室师兄说我糖液加得太多了，我是糖液和DPPH体积1:1做的，好多文献也都是1:1的，不知道是不是应该把糖液体积少加点呢？？

作者: 千里之外 时间: 2015-10-21 09:41

是的呢，样液在醇里溶解性很差，我试过把糖浓度降到0.4mg/ml，在2ml乙醇里加入200微升糖液也沉淀了。。
看到论坛里有说用CMC乳化剂的，但是找不到相关的文献。。。
还有用DMSO溶解DPPH的，但是那个好像基本是用液相做的，不知道如果用分光光度计的话波长应该多少呢。

作者: grace! 时间: 2015-10-21 09:45

试过甲醇呢，还是沉淀了
做了4个指标，只有两个做成功了，导师觉得两个不太够，想做做看FRAP法，不过试剂还没买来，只好先停了，等过完年下个学期再做了。
我想应该和多糖种类有关系，我有四个样，其中两个在DPPH中是不沉淀的，但是因为四个样要做对照，所以只能想办法统一一个方法。

作者: 巅峰时刻#-# 时间: 2015-10-21 09:49

是的，文献中抗氧化指标基本都是两个以上。文献中说FRAP与DPPH这两个方法的反应原理都是电子转移反应，结论的相关性或许比较高。我觉得根据自己的研究目的，指标主要应该是有代表性和针对性，文献中的好多指标得出的结果其实相关性很大的。呵呵，知易行难，愚见，共勉。

作者: hero_b 时间: 2015-10-21 09:52

确实是因为溶液浑浊吸光值比空白还高，稀释了之后趋势就对了，但是确实抗氧化性变小了，我也还还没解决，一起找办法……

作者: hero_b 时间: 2015-10-21 09:52

你有两个指标已经成功了？哪两个噢？

作者: 迷糊小鬼 时间: 2015-10-21 09:55

ABTS和羟基自由基。现在回家了，等下个学期再想办法解决

作者: apple_danny 时间: 2015-10-21 09:57

我以前用DPPH法测定不好，就改了ABTS法，用原液稀释不同倍数测定出来的结果确是稀释倍数越大，抑制率越高，因为溶液浑浊，所以我就拿原液稀释了5倍后，再用稀释后的溶液再稀释成不同倍数，数据趋势是对了，但是抑制率很低……苦恼啊，这个实验做了好久啊，就是找不到解决办法……大侠，你怎么弄的？

作者: today@ 时间: 2015-10-21 09:58

我没有出现这个问题呀，我做出来就是样品浓度越大，抑制率越高呀。不知道你的ABTS工作液是怎么配的呢？？

作者: today@ 时间: 2015-10-21 09:59

一般vc的浓度应该是多少比较好？我用0.5mg\ml 0.05mg\ml 0.025mg\ml 这三个浓度结果都90%多这个有问题吗？急求~

作者: 未完~待续 时间: 2015-10-21 09:59

不知道你是不是要用vc做标曲，如果你这三个浓度的清除率都是90%多，那说明较低浓度的VC的时候基本就把自由基清除差不多了，所以你可以考虑把浓度继续稀释，具体浓度，你试吧。

作者: 未完~待续 时间: 2015-10-21 09:59

其实我感觉楼主的样品既然是水溶而非醇溶就最好不用DPPH，水溶性的做ABTS, FRAP, 都很方便，我感觉测试体系如果用水配的，最好是水溶的，如果硬要用水溶的样品去用醇体系来做，虽然有的也有效果但效果会很差，IC50会很高

作者: 80年代的人 时间: 2015-10-21 10:00

你好，现在我们也在做这个实验，所出现的问题也是和你的一样，请问该如何做才可以避免出现絮状沉淀影响吸收值呢？很急很急！！！

作者: be!smile 时间: 2015-10-21 10:01 标题: 回复 #21 80年代的人的帖子

降低糖浓度试试吧，或者DPPH用一定浓度的乙醇-水溶液来溶解，不保证一定有效，因为我当时试了很多最后还是一样，就放弃了这个指标。祝实验顺利

作者: be!smile 时间: 2015-10-21 10:01

首先这个方法是不应该产生沉淀的，有沉淀一定会影响反应进行，根据多糖乙醇沉淀的特性，出现的沉淀应该是多糖，根据我的经验，应该是糖浓度太高造成的，建议降低多糖浓度，并且降低DPPh浓度，因为貌似你的空白吸光度也比较高。最后你的方法是对的，只是需要微调。

作者: be!smile 时间: 2015-10-21 10:01

可以用甲醇水这种混合溶剂吗？

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