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标题: 【求助】做DEAE-纤维素层析是怎么做 [打印本页]

作者: yazi 时间: 2015-10-27 10:52 标题: 【求助】做DEAE-纤维素层析是怎么做

不知道各位做DEAE-纤维素层析是怎么做的啊，我的蛋白等电点7.2，分子量30k作用，用葡聚糖凝胶层析没分开，现在想用DEAE-纤维素做下，看到书上说缓冲液选择，阴离子交换剂用tris缓冲液，阳离子交换剂用磷酸缓冲液，并且阴离子交换剂用磷酸缓冲液影响还很大，可很多文献依然是用ph7.8的50mmol的磷酸缓冲液，不知道什么情况，有的文献还用含有100 mmol／L NaCl的磷酸缓冲液(10 mmol／L，pH 6．1)进行一步洗脱，现在都不知道用哪个好了，请教各位我的这个蛋白应该选用什么样的纯化条件呢？

作者: 冰激凌 时间: 2015-10-27 10:53 标题: 回复

等电点7.2算是中性的，对于阴离子交换层析来说，你选用TRIS-HCL就行了，可以用8.5或者9.0的pH体系。你最好别用7.8，这与你的等电点只差0.6，不一定能吸附得好，最好是差别有1个单位，就是8.2以上的。蛋白质带的表面比净电荷越多，吸附得越强，要使用氯化钠的浓度越高才能洗脱，你如果选用7.8，那么不单只吸附不好，还比较容易洗脱下来，可能有点难与其它蛋白质分开。
缓冲系统所用的盐也是有离子强度的，所以不能选用浓度太大。20mM TRIS-HCL 的电导率大概为1.5%，你别用太高了。样品里的盐也最好去除得比较干净，因为如果盐浓度太高，会使得离子强度高，蛋白质没有被吸附就已经被洗脱了，吸附不上的。

作者: qinqinai 时间: 2015-10-27 10:53 标题: 回复

对于一种蛋白，就是说是中性蛋白，等电点是7.4或者说就是7.2，你如何确定是用阴离子交换层析还是阳离子交换层析了？

作者: 大大 时间: 2015-10-27 10:54 标题: 回复

很简单，楼主的蛋白质是阴阳离子交换层析都可以。但在这里，楼主使用的DEAE纤维素是弱阴离子交换层析柱填料，所以我就说说阴离子交换层析，不说阳离子交换层析。我建议楼主选用pH8.2-9的层析体系是基于楼主提供的填料。

作者: 跳跳哈里 时间: 2015-10-27 10:54 标题: 回复

那也就是说一种中性蛋白，其实就是阴离子交换层析和阳离子交换层析都可以的啦，但是选择到底是用那一种填料时是否有什么需要参考的因素，当然啦这个pH除外，就是说选择这两种填料时的pH都合适时我该怎么选择用何种填料了？

作者: xiaoxiaoai 时间: 2015-10-27 10:55 标题: 回复

就看你有什么填料或者层析柱，就用什么层析，看菜吃饭。要是效果达不到纯，就买别的。只能是试，如果不是数据足够，就不能分析出该用哪种的。

作者: aaby 时间: 2015-10-27 10:55 标题: 回复

二位讨论的很好，谢谢了，再弱弱的问下，我的酶液大概100ml，怎么浓缩啊？酶液太稀了，上柱子跑不集中，昨天用聚乙二醇浓缩了下，不知道是操作不对还是真的不行，酶失活了！！！用超滤的话料液太少，不知道该怎么办好了.....

作者: rrra6 时间: 2015-10-27 10:56 标题: 回复

看来跟我想的是一样的，呵呵，起初我以为有什么好的选择方法，但是一直没有在有关的书籍或文献中看到有关的内容，所以就想问问你看看有没有什么方法，谢谢啦！

作者: 蓝色雨梦 时间: 2015-10-27 10:57 标题: 回复

你用聚乙二醇浓缩是在4度吗？如果不是的话可能会影响。再就是这个聚乙二醇对你的酶有没有影响，如果有影响而你因为操作的原因让聚乙二醇进去的话也是一种可能性，我前段时间也是因为操作失误的原因，实验结果一直出问题，做了半年才找到原因。如果还是不行的，如果有条件可以考虑用超低温冷冻干燥。

作者: 青青草 时间: 2015-10-27 10:57 标题: 回复

离子交换层析吸附蛋白质是依靠配基与蛋白质结合的，如果填料装填紧密，那么蛋白质会立即与空位的配基结合而被吸附，如果上柱洗脱得不集中，可能是填料装填得不紧密，蛋白质在填料的空隙走空，未能与配基接触。
层析柱能吸附的蛋白质量与蛋白质样品的体积无关，只与蛋白质含量有关，理论上只要蛋白质不超过配基量即可，所以蛋白质样品体积与层析柱体积没有必然关系。我用柱床体积为20毫升的预装柱吸附过体积为350毫升的蛋白质样品，而淀粉酶不在穿透液中，全部在洗脱液中，原因就是层析柱的配基能全部吸附淀粉酶，无视样品体积。
PEG是线性分子，会在层析柱中残留，引起堵塞。我用过PEG4000，结果残留了一半，使得层析柱反压升高，所以我建议不用PEG来浓缩。而且说不定会影响酶活力。

作者: 妮子@ 时间: 2015-10-27 10:58 标题: 回复

我是直接把酶液装进透析袋然后用聚乙二醇埋住透析袋放在冰箱里的，不知道是什么原因了？？你是怎么做的啊？？

作者: 大花猫bb 时间: 2015-10-27 10:58 标题: 回复

我重新做了下ph7.8的50mmol的磷酸缓冲液，前面的小峰好像就是目标蛋白，这个条件不知道是不是把杂蛋白吸附而目标蛋白被洗脱，现在的问题就是目标蛋白很不集中，不知有好的办法没？填料装得确实不结实，23的纤维素填料很难压实。很纠结啊

作者: xiaoxiaojinglin 时间: 2015-10-27 10:59 标题: 回复

我是用聚乙二醇盖住透析袋中部，但是透析袋口千万不要沾上聚乙二醇

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