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标题: 为什么我扩增的PCR产物达不到预期的长度 [打印本页]

作者: ffooll 时间: 2011-9-22 16:11 标题: 为什么我扩增的PCR产物达不到预期的长度

为什么我扩增的PCR产物达不到预期的长度 [转载]

理论上应该扩增出超过2kb的片段，但每次得到的PCR产物都只有700多bp，跟这个基因的cDNA长度类似。换过好几个模板，得到的结果都相同。
上游引物：CATGAGCTACATCAATCTGCCC
下游引物：AGTCCAACCTGGGTAGGAG
Genebank上查到的序列：小鼠胸苷激酶（tk）基因M68489
1 ccatggcaga tccggaggga tggtcgagct ccaggctttt cacgtagctg agaggtggga
61 cgagtcttgt cttcgtcccg cccccttttg agttcgcggg caaatgcgag cagtaagtcg
121 aaatttttcc acccacggac tctcggtgct aactaaggtt tgcacagcag ccatgagcta
181 catcaatctg cccaccgtgc tgcccagctc ccccagcaag actcgggggc agattcaggt
241 gcggggtctg gagtggggtc gggtggtggc tggtgcgggg tgtacaaggg ggagacccct
301 taaatgactt ctcttctagg tgattctcgg gcccatgttc tcagggaaaa ggtaatgaat
361 gggccttcgg ggcggtgggc ctccctctct ctctgcagcc tctctctctg caggccctgg
421 ctctcctctc ccccctcccc catcttccag gagcctctga ctaggcggca aacgcgctcg
481 acctctgtgt gtacattccc gcccaaaatt cgatttcctg gattgctgcc atcctcctgc
541 ccaagccttt tctcttgggg aaccctatct ttgctgaggc ggaccacatg ggggtacaat
601 tgaagacccc agcccacatt acccaggagc cccaccgaac tctcatgtgt ccctgggagt
661 taggcacctt ctctgacagt ttcctcattc attccccatg cgagctccta agctggagcc
721 aattaactct gaggtgaggt ctaaactctg gagtcccacc cagaataaca ggctaccgac
781 gctaggtggt agtggcagcc cgccttttgc tcgggcctca tgtgctctgg ttaattcttg
841 cagcacagag ctgatgagaa gagtccggcg cttccagatc gcccagtaca agtgcctggt
901 catcaagtat gccaaagaca cgcgctatag caacagcttc tccacacatg atcggtcagt
961 cctacccctg agcctgccct tcggaaaccc ctaagcctcg ggggcacact gactgctagc
1021 ctctagtgga tatgaataag tgctcaaaac tactagatac tgtccagtgt catgtaccac
1081 gagctggaga ctgtcactgt agagctgcag attaggtgac actatagaat actcaagctt
1141 ggtctctgcc cttgctcatt cttggccttc tcttcccagg aacaccatgg acgcattgcc
1201 agcctgcatg ctccgcgatg tgacccagga ggccttgggt gtggccgtca ttggcatcga
1261 tgaggggcag tttgtaagtc agcctgcagc ataacctcac cctgacccct gacccttcct
1321 gccctgctga ctcagaagtc cctgtcatta acttgtcttt actggggtgc ggatccaatt
1381 cgccctatag ctgagtcgat acaatcactg gcgtcgtttg catgctcagc tcccccacgg
1441 tcttcgtcag gcccttgcct ggggcagata acctcatcct ctggactttt cccagtttcc
1501 tgacattgtg gatttctgtg aaatgatggc caacgagggc aagacagtaa ttgtggcagc
1561 gctggatggg accttccaga ggaaggtaag atgtctgact ctggcttggc acagtgcaga
1621 ggcacagctc ctgacgttgc tctctggccc ccacacacat acacatgtga acacaggcag
1681 aggagggagg tgcctggcta actgaccgca cacacctgct gctgtcttcc gtgcaggctt
1741 tcggcagcat cttgaacctg gtgcccctgg cggagagtgt ggtgaagctc accgctgtgt
1801 gcatggagtg cttccgagaa gctgcctaca cgaagaggct gggcctggag aaagaggtac

作者: ffooll 时间: 2011-9-22 16:12

1861 acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacaaca
1921 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacttact tctgcccaag gagtggggtg
1981 ggcttaggct ctggcttctg agtcccaccc tcacatctcc ctcccaccag ggtgaggtga
2041 ttgggcctgg agaaagaggt atacacacac acacacacac acacacacac ttctgcccaa
2101 ggagtggggt gggcttaggc tccggcttct gagtcccgcc ctcacatctc cctcccacca
2161 ggtggaggtg attggcggag ccgacaagta tcactccgtg tgccgcctgt gctactttaa
2221 gaagtcttca gcccagactg ctggctcaga caacaagaac tgtctggtgc tggggcagcc
2281 gggagaggcc ttggttgtca ggaagctctt tgcctctcag caagtcctac aatacaactc
2341 tgccaactga ggggacctga ggcctgccag ctcctaccca ggttggactc tcagagagca
2401 gggggagcgc gggcctgcca ttcctaatgg acaatgtacc ttgaacaggc tgccactcgc
2461 tgaagccgtt ttcagttccc ttcttgattg ccaagatgcc tcaatgcaga ctggagccca
2521 gaccctgcct ggtggctagc ggtcccgtgt tcagccaaag gtgaggacag agctgtccag
2581 cattgtgaca ctggtggggc tagtttcttc cttgttcgtg gctgggtttc agtctcagag
2641 ccccaccctc accaaggctc cacgcctctc acagctcccc catttatgcc taaacattct
2701 ctcctcagaa cctcagctct tagtgagcca cttttcttgt gcaaaatgaa caatattaaa
2761 gtttactact aatgagaacg tgtttctcct tagcctgggt ttccctaact tgcaaccggc
2821 acccacatga cttgggggta gaaatgtgtt ttgtagtacc aatggtctca ccacagccca
2881 agaagaacag tcccccacat ttctatctgg ttggtttcgt gacaaaaaat ggcaaagaa
PCR条件：94℃7min，（94℃1min，58℃30s，72℃4min）×30，72℃10min。
后来换了一对引物。
上游引物：5' AgC AgC CAT gAg CTA CAT CAA TC 3'
下游引物：5' gAg Tgg CAg CCT gTT CAA ggT AC 5'
再用同样的条件扩增就完全没有产物了。
各位帮帮忙啊，看看到底哪里有问题。
谢了先。

作者: ffooll 时间: 2011-9-22 16:13

第二对引物的下游引物写错了，应该是5' gAg Tgg CAg CCT gTT CAA ggT AC 3'。

作者: mooon 时间: 2011-9-22 16:14

也许有同源序列，或者污染1
提高温度！94度只要30秒够了！退火温度提高到62度

作者: caihong 时间: 2011-9-22 16:15

首先，建议将退火时间改为1分钟，退火温度可在60度左右调整。
其次，你所用的体系可能不适合你要扩增的片段，建议使用长片段扩增体系。

作者: 菠萝菠萝蜜 时间: 2011-9-22 16:15

变性时间缩短到30秒了，退火温度在60度、62度，时间延长到1分钟，都没有产物。

作者: guagua 时间: 2011-9-22 16:18

重新合成一条或者两条中间引物，与你现在使用的引物分别成为一对引物，预期PCR产物为1-1.5kb，看能不能扩增出来。

如果至少有一端能扩出来，那问题就好办一些。你觉得呢？

作者: Darcy 时间: 2011-9-22 16:19

最大的问题在于：

你的序列中的碱基组成很不均匀（具体见附图分析），连续的G或C很多见，所以虽然平均的GC含量为55%左右，但局部的GC含量有的甚至高达80%,所以常规的PCR很难奏效。

建议使用高GC扩增条件。比如可以使用TAKARA的2XGC BUFFER 配合LA TAQ酶来扩增。

[ 本帖最后由 Darcy 于 2011-9-22 16:46 编辑 ]

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作者: Darcy 时间: 2011-9-22 16:46

此外，很不明白的是：为啥你要扩基因组序列，而不直接扩增CDNA。

作者: 果冻也酸 时间: 2011-9-22 16:46

请问你上面分析产物GC比的软件是什么呀？
谢谢！

作者: 喵咪 时间: 2011-9-22 16:47

最大的问题在于：

你的序列中的碱基组成很不均匀（具体见附图分析），连续的G或C很多见，所以虽然平均的GC含量为55%左右，但局部的GC含量有的甚至高达80%,所以常规的PCR很难奏效。

建议使用高GC扩增条件。比如可以使用TAKARA的2XGC BUFFER 配合LA TAQ酶来扩增。

最好看看其他文献是否有直接通过PCR扩增出该片段的，和作者直接联系一下。

作者: 大猫 时间: 2011-9-22 16:47

只有使用TAKARA的2XGC BUFFER 配合LA TAQ酶来扩增局部GC含量高的片段这一种办法吗？

有没有其他办法？土土的问：例如巢式PCR可以的吗？

作者: Darcy 时间: 2011-9-22 16:48

只有使用TAKARA的2XGC BUFFER 配合LA TAQ酶来扩增局部GC含量高的片段这一种办法吗？

有没有其他办法？土土的问：例如巢式PCR可以的吗？

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1。扩增高GC含量的方法可能有其他。
2。巢式PCR解决的不是这个问题。

作者: 大猫 时间: 2011-9-22 16:48

在PCR体系中加入DMSO是可以降低GC比例的，还有其他的办法吗？？

作者: 大猫 时间: 2011-9-22 16:49

请问你上面分析产物GC比的软件是什么呀？
谢谢！

作者: ffooll 时间: 2011-9-22 16:50

多谢各位。
把退火温度降到50度，得到的片段在700多。？
还没找到扩增整个tk基因的文献。
我想试试TAKARA的2XGC BUFFER 配合LA TAQ酶来扩增的方法。
再谢。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-9-22 16:50

建议：
1。模板处理：要得到完整的模板，纯度要达到要求。这是要扩增到2kb基因的前提。
2.反应体系：要合适。一般教科书上的反应体系，扩增2kb应该没有问题。
3.可以用高保真的聚合酶。也可以用一些公司的试剂盒如：华美公司的5Kb高保真试剂盒。
知觉上，你的第二对引物要好一些。

作者: =菓子= 时间: 2011-9-22 16:50

试过MBI的pfu酶和NEB的vent，结果跟普通的Taq差不多。

作者: =菓子= 时间: 2011-9-22 16:51

TAKARA的 LA TAQ酶with 2XGC BUFFER试过了，没有产物。
郁闷～～

作者: 森林木 时间: 2011-9-22 16:51

反应系统有没有问题？

作者: 飞天小鹿 时间: 2011-9-22 16:56

要解决没有预期扩增产物问题,我认为:
第一：,保证模板的质量,提取完整性较好的模板,要在基因组DNA提取上下些功夫.
第二,引物的特异性和扩增效率要高.
在保证上述的前提下,即使使用普通TAQ,调整一下PCR的扩增条件,扩出预期大小的片段指日可待.
总之,不要着急,认真做好每一个环节,问题不大,因为你扩的是已知序列.

作者: =菓子= 时间: 2011-9-22 16:59

反应系统不该有什么问题吧。

作者: 岸上的鱼 时间: 2011-9-22 16:59

你有没有用Blast检查过, 看看是不是有同源或类似基因?

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