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标题: 请教管家基因 [打印本页]

作者: 雪花子 时间: 2011-9-22 17:30 标题: 请教管家基因

请教管家基因 [转载]

请教：1. 做半定量RT-PCR,是同管扩增还是异管扩增更被认可？
2.对人的正常和病变组织，是选择b-actin 还是GAPDH?
3. 因为目标基因是自己设计和引用文献的的，b-actin买的成品，没考虑是否有引物间的干扰。但同管能把两者都扩出来，是否还要再查一下的序列是否相互形成二聚体呢？

请各位高人指导。

作者: =菓子= 时间: 2011-9-22 17:30

请教：1. 做半定量RT-PCR,是同管扩增还是异管扩增更被认可？
2.对人的正常和病变组织，是选择b-actin 还是GAPDH?
3. 因为目标基因是自己设计和引用文献的的，b-actin买的成品，没考虑是否有引物间的干扰。但同管能把两者都扩出来，是否还要再查一下的序列是否相互形成二聚体呢？

请各位高人指导。

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你的这些问题很多资料都有说明，包括权威的nature,science等，其实做半定量目前最值得看好和推崇的方法就是自己做内参，不要看家基因做，主要原因是考虑到所有的看家基因，包括你说的b-actin ，GAPDH，还有28S RNA都存在不同条件表达量会改变的结果，有几篇文献都描述了这几种看家基因作为内参的特点，比较了其优缺点，倒是大家都很推崇28SRNA它的“稳定”性！
刚才说了，自己做内参已经不是什么新鲜的事了，2001，02就有这样的文章发表了，这样的做法可以排除管与管间的差别，也能排除引物与引物间的差别，因为这种方法采用的竞争性的模板，用的是相同的引物，在同一个管内进行！这样的一个方法基本上不存在你问的问题！：）
这个方法相对比较麻烦一点，做的东西多一些，你实在不想这样做，也没所谓的，还是照老方法做吧，我想同管和异管都曾经实施过，你看看资料吧！
半定量不是很准，因为最终要确定还是要依赖Nothern!

作者: purrr 时间: 2011-9-22 17:31

补充一下ALEX的说法，有的表达丰度低的mRNA 要信赖定量PCR，因为Northern 敏感度不够。我们就在这个问题上栽过，试了好久也试不出，上多少样也不成。

作者: 金手指 时间: 2011-9-22 17:31

选内参要谨慎啊。这些所谓的看家基因分别在某些疾病会有表达差异的。我用actin就栽了跟斗啦。

作者: 微笑的海豚 时间: 2011-9-22 17:32

补充一下ALEX的说法，有的表达丰度低的mRNA 要信赖定量PCR，因为Northern 敏感度不够。我们就在这个问题上栽过，试了好久也试不出，上多少样也不成。

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同意你的看法！用real-time是最好的！

作者: 雪花子 时间: 2011-9-22 17:32

谢谢各位指导。
real-time PCR 成本太高了，未敢问津。：p

to Duke_SM
请问如何发现b-actin在疾病中的变化的？我在比较炎症和正常组织中某种多肽的表达，用actin作内参。:p

thanks

作者: 长发piaopiao 时间: 2011-9-22 17:33

比较难，也根本不可能去做因为那将与你的课题相离太远，可以查查相关的文献，另外可以参考文献中类似的研究所用的内参照:p

作者: 回眸 时间: 2011-9-22 17:33

我是搞肿瘤的。用actin做内参，发现所有的靶基因在肿瘤中都低表达，有点怀疑，然后把癌组织连同癌旁正常组织切一块下来，免疫组化，就知道actin在肿瘤高表达。我当然不是说在所有肿瘤中，actin都高表达，只是我研究的这种。

作者: 喵咪 时间: 2011-9-22 17:34

半定量real-time PCR(使用Sybr green,Roche)价格相对便宜.

具体见cuturl('http://www.wzw.tum.de/gene-quantification/')

作者: 韩梅梅 时间: 2011-9-22 17:34

我是搞肿瘤的。用actin做内参，发现所有的靶基因在肿瘤中都低表达，有点怀疑，然后把癌组织连同癌旁正常组织切一块下来，免疫组化，就知道actin在肿瘤高表达。我当然不是说在所有肿瘤中，actin都高表达，只是我研究的这种。

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b-actin ，GAPDH，还有28S RNA这三种内参文献比较的结果表明最后一个似乎还比较稳定!

作者: 小鱼鱼 时间: 2011-9-22 17:35

我正在做半定量PCR的课题，也准备用actin做内参。
请问alex119 ：如何自己做内参？我不太懂你的意思。能提供几篇参考文献吗？非常感谢！

作者: 不懂 时间: 2011-9-22 17:35

我正在做半定量PCR的课题，也准备用actin做内参。
请问alex119 ：如何自己做内参？我不太懂你的意思。能提供几篇参考文献吗？非常感谢！

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我觉得biotechniques上很有几篇这样的文章。你查查看，我上网不是很方便，如果要发给你也许要等几天的！所谓自己做的内参其实就是做一个和靶RNA能互相竞争的mRNA（体外合成），所采用的原理仍然是竞争性的PCR，虽然烦琐一点，但是很能说明问题！

作者: 雪花子 时间: 2011-9-22 17:36

楼上的各位兄台
我是选用定量PCR来显示两个片段的差异的,而且选的参照是其它染色体上的片段,所以设计乐两对引物,可有个问题很苦恼,就是再不同模板浓度时,同是正常人,结果差异很大
有谁能指点我一下吗?或有什么类似的资料推荐吗?
万分感谢,因为我和急,结果不好老板脸色不怎么好看!!!

作者: 大虾米 时间: 2011-9-22 17:36

楼上的各位老师或师兄师姐大家好，我是学植物病理的，也想要做定量PCR或半定量PCR，现在有两个菌株，一个致病，一个非致病，它们同属于一个种，主要是想要看致病的菌株的量，但问题是我没有这个菌株的特异性标记，不过我知道它的序列，请问我要如何准备实验，还需要些什么条件，要注意些什么问题？

作者: coolcool 时间: 2011-9-22 17:37

我试验是提取培养的细胞RNA做RT-PCR，选用beta2-微球蛋白做内参，也是根据参考文献作的，理由是其表达丰度低，做半定量相对可靠。看了不是太能理解的。很想知道有哪十几种管家基因，它们表达的丰度如何。

作者: 大仙 时间: 2011-9-22 17:37

你是学那种肿瘤的？是不是胃癌的？我要做胃癌的脂氧和酶的方面RT-PCR，用什么做内参呢？急急急！！！

作者: ha111 时间: 2011-9-22 17:38

To obtain valuable data, it might be better to use /try 3-4 internal controls if possible esp economy available .otherwise, publication is publication, you can get your data published, but---- you know it all. it's just my personal opinion.

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