分析测试百科

标题: 引物设计的疑惑 [打印本页]

作者: 冰儿0109 时间: 2011-9-23 10:47 标题: 引物设计的疑惑

引物设计的疑惑[转载]

我最近用PRIMER5.0验证SCIENCE的一篇文献中的引物(12条,20缄基/条),发现每条引物只有5个硷基和MRNA互补,不知什么缘故,想听听大家的看法.

作者: 不懂 时间: 2011-9-23 10:48

你确定在primer5.0所用的序列和文献中所引用的是一致的吗？

作者: boom 时间: 2011-9-23 11:08

我最近用PRIMER5.0验证SCIENCE的一篇文献中的引物(12条,20缄基/条),发现每条引物只有5个硷基和MRNA互补,不知什么缘故,想听听大家的看法.

=================================================================

建议您先确定所用的序列是否正确，一般情况下不会出现这种情况的

可以从序列号，对应的amino acid等序列情况对比一下，看看是不是就是文献中的序列

如果还是不行的话，请您把文献公布一下，大家集思广益看个究竟。

作者: 小困 时间: 2011-9-23 11:08

如果这些引物加了两个酶切位点和三个保护碱基的话正好20个，呵呵，你看看引物里有没有酶切位点吧

作者: 冰儿0109 时间: 2011-9-23 11:09

mouse  Forward primer reverse primer
insulin I  TAGTG ACCAG CTATA ATCAG AG 5ACGCC AAGGT CTGAA GGTCC
insulin II  CCCTG CTGGC CCTGC TCTT 5AGGTC TGAAG GTCAC CTGCT
glucagon  TCATG ACGTT TGGCA AGTT 5CAGAG GAGAA CCCCA GATCA
IAPP  GATTC CCTAT TTGGA TCCCC 5CTCTC TGTGG CACTG AACCA
Glut2  CCACC CAGTT TACAA GCTC 5TGTAG GCAGT ACGGG TCCTC
PDX-1  TGTAG GCAGT ACGGG TCCTC 5 CCACC CCAGT TTACA AGCTC
acarboxypeptidase A  GCAAA TGTGT GTTTG ATGCC 5 ATGAC CAAAC TCTTG GACCG
OCT-4  GGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTC 5 CTCGAACCACATCCTTCTCT
GATA-4  CGCCGCCTGTCCGCTTCC  5 TTGGGCTTCCGTTTTCTGGTTTGA
HNF3b  ACCTGAGTCCGAGTCTGACC  5 GGCACCTTGAGAAAGCAGTC
请各位看看有没有酶切位点
另外，我查到的MRNA序列(mouse)如下：
insulin 1 cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=31982248')
INSULIN2 cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=31982250')
glucagon cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=34328120')
IAPP cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=6754271')
GLUT2 cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=00414678&dopt=GenBank')
PDX-1 cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=31560657')
OCT-4 cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=31980770')
GATA-4 cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=6679952')
HNF3b cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=22074389')
ACTIN BETA cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=6671508')

图片附件: 66596074.jpg (2011-9-23 11:09, 42.58 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8604

作者: 韩梅梅 时间: 2011-9-23 11:09

mouse  Forward primer reverse primer
insulin I  TAGTG ACCAG CTATA ATCAG AG 5ACGCC AAGGT CTGAA GGTCC
insulin II  CCCTG CTGGC CCTGC TCTT 5AGGTC TGAAG GTCAC CTGCT
glucagon  TCATG ACGTT TGGCA AGTT 5CAGAG GAGAA CCCCA GATCA
IAPP  GATTC CCTAT TTGGA TCCCC 5CTCTC TGTGG CACTG AACCA
Glut2  CCACC CAGTT TACAA GCTC 5TGTAG GCAGT ACGGG TCCTC
PDX-1  TGTAG GCAGT ACGGG TCCTC 5 CCACC CCAGT TTACA AGCTC
acarboxypeptidase A  GCAAA TGTGT GTTTG ATGCC 5 ATGAC CAAAC TCTTG GACCG
OCT-4  GGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTC 5 CTCGAACCACATCCTTCTCT
GATA-4  CGCCGCCTGTCCGCTTCC  5 TTGGGCTTCCGTTTTCTGGTTTGA
HNF3b  ACCTGAGTCCGAGTCTGACC  5 GGCACCTTGAGAAAGCAGTC
请各位看看有没有酶切位点
另外，我查到的MRNA序列(mouse)如下：
insulin 1 cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=31982248')
glucagon cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=34328120')
IAPP cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=6754271')
GLUT2 cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=19465565')
PDX-1没查到
OCT-4 cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=31980770')
GATA-4 cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=6679952')
HNF3b cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=22074389')

-=============================================================================================================

我给你查的，以insulin I为例：

ggggggntttagtgaccagctataatcagagaccatcagcaagcaggtcattgtttcaacatggccctgttggtgcacttcctacccctgctggccctgcttgccctttgggagcccaaacccacccaggcttttgtcaaacagcatctttgtggtccccacctggtaaaggctctttacctggtgtgtggggagcgtggctttttttacacacccaagtcccgccgtgaagtggaggacccacaagtggaacaactggagctgggaggaagccccggggaccttcagaccttggcgttggaggtggcccggcagaagcgtggcattgtggatcagtgctgcaccagcatttgctccctctaccagctggagaactactgcaactaaggcccacctcgacccgccccacccctttgcaatgaataaaacttttgaataagcaccaaaaaaaagagttttataatgaatg

你自己用文献里的引物比一下，是不是正确的

好了，自己再看看是不是

作者: 冰儿0109 时间: 2011-9-23 11:10

虽然我查的和你查的连接地址不同，但都是GI:31982248

作者: #甜# 时间: 2011-9-23 11:10

酶切位点有，你可以通过premier分析它的酶切位点，我看了前两个，酶切位点都是很少见的酶，估计不是设计上的。

作者: +田田+ 时间: 2011-9-23 11:11

虽然我查的和你查的连接地址不同，但都是GI:31982248

===========================================================

你不是觉得，文献里的primer不是完全和mRNA里的序列能对应上么？

我找了一个insulin I，但是我验证后，primer和mRNA的序列是完全对应上的啊

不知道你为什么提到只有5个base能对上

作者: 冰儿0109 时间: 2011-9-23 11:12

你不是觉得，文献里的primer不是完全和mRNA里的序列能对应上么？

我找了一个insulin I，但是我验证后，primer和mRNA的序列是完全对应上的啊

不知道你为什么提到只有5个base能对上

=================

我又试了一次,还是不行.

图片附件: 66541146.jpg (2011-9-23 11:13, 54.63 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8605

作者: 冰儿0109 时间: 2011-9-23 11:13

上面是上游引物,这是下游引物

图片附件: 28437837.jpg (2011-9-23 11:14, 51.49 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8606

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-9-23 11:14

我又试了一次,还是不行.

===============================================================================================================

你把引物和模板的结合原理混淆了，我给你重新修改了一下图，你看了就明白了

上游引物和GENEBANK中给的序列的互补链结合，所以，引物是不反向的，由于你把引物反向了，当然就结合不上去了。这个是你出现错误的根本原因。

OK，下游引物我就不贴图修改了，你自己试试，看看我说的对不对。

注你这次好运拉

图片附件: 23007699_snap.jpg (2011-9-23 11:14, 47.64 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8607

作者: 冰儿0109 时间: 2011-9-23 11:15

我找到新方法,就是直接到BLAST查,见下图:BLAST后查找MRNA找到两个结果,但只有一个结果包含两条引物,如下.用298-10便得到扩增片段长度,很方便.

图片附件: 89885359.jpg (2011-9-23 11:15, 27.62 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8608

作者: @木木@ 时间: 2011-9-23 11:16

我现在用B-actin做为RT-PCR的内参,是不是可以用楼上的引物序列啊?(

作者: 冰儿0109 时间: 2011-9-23 11:16

恐怕不行,根据PRIMER5分析这对引物存在DIMER和HAIRPIN,而且Tm相差9度(53.6-44.9)。其他战友可否可以推荐几条引物呢？

作者: 冰儿0109 时间: 2011-9-23 11:17

我现在用B-actin做为RT-PCR的内参,是不是可以用楼上的引物序列啊?(

==============================================================================================================

不过SCIENCE那篇文章的引物在PRIMER中的PRODUCT RATING比PRIMER搜到的引物得分高(51)。我还有一对ROCHE公司的引物，如下：
Comparison of C. therm. Polymerase One-Step RT-PCR System and Tth DNA Polymerase

The C. therm. Polymerase One-Step RT-PCR System was compared with Tth DNA Polymerase for ability to amplify limiting amounts of a 324 bp b-actin sequence from mouse RNA. Total RNA was isolated from mouse liver and used for one-step RT-PCR.

Each reaction mix (50 µl total volume) contained template RNA (0,1 ng to 100 ng mouse liver RNA), enzyme (either 6 units C. therm. Polymerase mix, 5 units Tth DNA Polymerase, or 15 units Tth DNA Polymerase), reverse and forward PCR primers, PCR Nucleotide MixPLUS and buffer components recommended for optimal enzyme activity. The forward (5'-AGC TTG CTG TAT TCC CCT CCA TCG TG-3') and the reverse primer (5'-AAT TCG GAT GGC TAC GTA CAT GGC TG-3') were designed to amplify a 324 bp sequence from b-actin mRNA. The RT reaction was performed at 60°C for 30 min, followed by PCR in a Perkin Elmer Model 9600 Thermal Cycler with the following thermal profile:

· Initial denaturation: 94°C, 2 min

· 10 cycles of denaturation (94°C, 30 s),
annealing (60°C, 30 s), elongation (68°C, 60 s)

· 25 cycles of denaturation (94°C, 30 s), annealing (60°C, 30 s), elongation (68°C, 60 s + 5 s/cycle)

· Final extension: 68°C, 7 min.
它的得分是42，低于SCIENCE的引物，高于PRIMER搜到的引物，也可考虑使用。

作者: 冰儿0109 时间: 2011-9-23 11:18

补充一下，SCIENCE的引物Tm相差10度，ROCHE的引物相差1度，两家引物都有HAIRPIN和DIMER，RATING反映的是匹配度评分，匹配度低的引物对常常不太有效。因为在同样退火温度下Tm低的引物决定扩增的特异性，而Tm高的引物更易于形成非特异性结合而造成错误的起始。

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)