分析测试百科

标题: 提取组织样品中的病毒DNA [打印本页]

作者: mod=8048 时间: 2011-9-24 08:40 标题: 提取组织样品中的病毒DNA

提取组织样品中的病毒DNA [转载]

今天一天都没吃肉,主要因为上午做了4个组织样品的核酸提取前处理.
差点晕死了,样品是在-20度冰箱里保存的前年的可疑组织病料,刚拿出来还好,一会儿就受不了了,我用的是一个食品DNA提取试剂盒,1克样品要加2毫升BUFFER,结果我的样品一个也有10克,眼看试剂盒里的试剂都要见底了,我就没做了
请教:有用于大量临床样品病毒DNA提取的试剂盒吗?

作者: =菓子= 时间: 2011-9-24 08:41

www.qiagen.com

作者: mod=8048 时间: 2011-9-24 08:42

几乎都是用于血液样品的DNA提取,还有一个是用于小剂量组织DNA的提取,我的样品太多了,不知该怎麽办

Genomic DNA Stabilization and Purification from Clinical Samples for Research Applications
Collection, stabilization, and DNA purification

Blood, collection and DNA stabilization
PAXgene Blood DNA Tubes

Blood, DNA purification
PAXgene Blood DNA Kit

Blood, collection, DNA stabilization, and purification in one system
PAXgene Blood DNA Validation Kit

Genomic and viral DNA purification from blood and blood-derived samples

Blood and cell-free body fluids, spin-column format
QIAamp DNA Blood Mini Kit
QIAamp DNA Blood Midi Kit
QIAamp DNA Blood Maxi Kit

Blood, flexible starting volumes, genomic DNA only
FlexiGene DNA Kit

Blood and blood-derived samples, 1–6 samples in parallel, automated
EZ1 DNA Blood Card
EZ1 DNA Blood 350 ul Kit
EZ1 DNA Blood 200 ul Kit

Blood, up to 48 samples (100–200 µl) per run, automated
MagAttract DNA Blood Mini M48 Kit

Blood, up to 48 samples (250–350 µl) per run, automated MagAttract DNA Blood Midi M48 Kit
Blood, 96-well format
QIAamp 96 DNA Blood Kit

Blood, 96-well format, automated
QIAamp DNA Blood BioRobot MDx Kit
QIAamp DNA Blood BioRobot 9604 Kit
MagAttract DNA Blood M96 Kit

Very small amounts of blood, tissue, and forensic samples, minimal elution volumes QIAamp DNA Micro Kit
Dried blood, 1–6 samples in parallel, automated EZ1 DNA Dried Blood Card
EZ1 DNA Tissue Kit
Buffy coat, 1–6 samples per run, automated
EZ1 DNA Buffy Coat Card
EZ1 DNA Blood 350 ul Kit

作者: mod=8048 时间: 2011-9-24 08:42

Genomic and viral DNA purification from tissue and other clinical samples

Clinical tissue samples, spin-column format QIAamp DNA Mini Kit
Clinical tissue samples, 1–6 samples in parallel, automated
EZ1 DNA Tissue Card
EZ1 DNA Tissue Kit

Clinical tissue samples, plus a wide range of other human samples, up to 48 samples per run, automated MagAttract DNA Mini M48 Kit
Clinical tissue samples, plus a range of biopsy samples, up to 96 samples per run, automated MagAttract DNA Tissue M96 Kit
Swabs, 1–6 samples in parallel, automated EZ1 DNA Buccal Swab Card
EZ1 DNA Tissue Kit
Swabs, 96-well format, automated QIAamp 96 DNA Swab BioRobot Kit
Forensic samples, 1–6 samples in parallel, automated
EZ1 DNA Forensic Card
EZ1 DNA Tissue Kit

Paraffin-embedded samples, 1–6 samples in parallel, automated
EZ1 DNA Paraffin Section Card
EZ1 DNA Tissue Kit

Stool samples
QIAamp DNA Stool Mini Kit

Very small amounts of blood, tissue, and forensic samples, minimal elution volumes QIAamp DNA Micro Kit

Bacterial and parasite DNA purification

Blood and cell-free body fluids QIAamp DNA Mini Kit
Very small amounts of blood and related body fluids, minimal elution volumes QIAamp DNA Micro Kit
Stool samples
QIAamp DNA Stool Mini Kit

作者: mod=8048 时间: 2011-9-24 08:45

Viral DNA purification

Cell-free body fluids, spin-column format
QIAamp UltraSens Virus Kit

Plasma, serum, and cell-free body fluids, minimal elution volumes QIAamp MinElute Virus Spin Kit
QIAamp MinElute Virus Vacuum Kit
Cell-free body fluids, 96-well format, automated
QIAamp Virus BioRobot MDx Kit
QIAamp Virus BioRobot 9604 Kit

Total nucleic acid purification

Cultured cells and blood, 1–6 samples in parallel, automated
EZ1 RNA Card
EZ1 RNA Cell Mini Kit

Cultured cells and blood, up to 48 samples per run, automated MagAttract RNA Cell Mini M48 Kit

Robotic systems for clinical research

作者: 庄梦蝶 时间: 2011-9-24 08:46

如果非要大量提取的话，建议你别用试剂盒了，买点蛋白酶K，饱和酚等手工提吧。这么大量提取用试剂盒反而不如手工提得率高、效果好的。

作者: she 时间: 2011-9-24 08:46

大量提取是最好用自己配的试剂了。

病毒一定要灭活的。

蛋白K消化3小时就够了，浓度可以高点。后面再用酚处理。

你可以用盐沉淀的方法，蛋白K消化后加入0.2M NacL（终浓度）.斡旋后离心取上清，下面是蛋白沉淀。

可以看看分子克隆书，上面游些。

作者: mod=8048 时间: 2011-9-24 08:47

非常谢谢两位的帮助,我今天就去翻一下书,配试剂
我又想了个办法,研磨组织,然后反复冻融,先低速然后超速离心,沉淀病毒离子,然后再提取,是不是可以节约试剂呢?
请教一下!!有没有可行性!

作者: 韩梅梅 时间: 2011-9-24 08:48

没有做过，但应该可行。一般做病毒培养时是这样收毒的。不过培养时细胞量很少的，你的组织至少10g，工作量仍然不小，可以先做一份试试看。

作者: 小蜜蜂 时间: 2011-9-24 08:48

问一下，为什么非用这么大的样品呀？10g,太大了。

作者: 小蜜蜂 时间: 2011-9-24 08:49

还有哦，听说反复冻融是不好的。
我对PCR可是真正的菜鸟，说的不对别介意哦！

作者: mod=8048 时间: 2011-9-24 08:50

好,先试试
因为病料是可疑病料,采了很久了,没有做确诊,所以不好进行病料的筛选,只有全部拿来做了.
反复冻融主要是破坏细胞壁,释放病毒粒子,当然对病毒会有一定损伤,但应该不会影响PCR吧.我乃菜鸟也哦!

作者: #甜# 时间: 2011-9-24 09:19

反复冻融主要是释放病毒粒子，增加病毒粒子的含量。但是不会对接下来的试验有影响，因为我们就是想获得病毒的DNA或是RNA，不破坏怎能释放出来呢。
沉淀病毒，除了用超离外，可以用PEG沉淀法分离病毒粒子，我觉得比超离省事还简单，不妨可以试试。

作者: 小蜜蜂 时间: 2011-9-24 09:20

反复冻融主要是释放病毒粒子，增加病毒粒子的含量……

是这样的呀！
可能我看的资料太老了；（
再去问问我老师……

作者: mamamiya 时间: 2011-9-24 09:20

请问PEG沉淀法怎麽做,需要配的试剂好象比较多是吗?
使用于大量组织样品中病毒DNA的提取吗?

作者: 小葵 时间: 2011-9-24 09:21

PEG沉淀法分离病毒粒子并不需要很多试剂，操作还是比较容易的，我做的主要是针对细胞，获得病毒粒子，具体方法如下：
PEG溶液配制：30％聚乙二醇6000-8000，1.2M NaCl，过虑
操作步骤：1、250g 4℃下离心悬浮细胞10min，将悬浮物转移至一新离心管。
对于贴壁细胞，最初离心步骤可省略。
2、8000g 4℃下离心悬浮物10min。
3、将悬浮物转移至新离心管，每2ml悬浮物中加1mlPEG溶液，充分混合，于冰上孵育过夜。
4、8000g 4℃下离心10min。
5、弃掉悬浮物，仔细吸弃残余PEG溶液，
作者: 小葵 时间: 2011-9-24 09:21

PEG沉淀法分离病毒粒子并不需要很多试剂，操作还是比较容易的，我做的主要是针对细胞，获得病毒粒子，具体方法如下：
PEG溶液配制：30％聚乙二醇6000-8000，1.2M NaCl，过虑
操作步骤：1、250g 4℃下离心悬浮细胞10min，将悬浮物转移至一新离心管。
对于贴壁细胞，最初离心步骤可省略。
2、8000g 4℃下离心悬浮物10min。
3、将悬浮物转移至新离心管，每2ml悬浮物中加1mlPEG溶液，充分混合，于冰上孵育过夜。
4、8000g 4℃下离心10min。
5、弃掉悬浮物，仔细吸弃残余PEG溶液，然后在进行下面的提取操作即可。

我做的量比较小，但若量大，就按比例相应扩大呗。
作者: 阿拉蕾 时间: 2011-9-24 09:21

非常谢谢两位的帮助,我今天就去翻一下书,配试剂
昨晚睡觉前我又想了个办法,研磨组织,然后反复冻融,先低速然后超速离心,沉淀病毒离子,然后再提取,是不是可以节约试剂呢?
请教一下!!有没有可行性!

==============================================

这个方法我用过，去年做禽流感时用的，我们的具体方法是：
1.拍击式均质器粉碎组织，取反复冻融的组织液和血水
2.10000rpm离心去处组织碎片和其他杂质
3.3.5万rpm 4h离心沉淀病毒
4.提取病毒RNA
5.定量PCR

结果很好
作者: mod=8048 时间: 2011-9-24 09:23

组织碎片和杂质，你用于提取病毒了吗？
还是只提取了3.5万rpm的病毒沉淀
作者: mod=8048 时间: 2011-9-24 09:23

组织碎片和杂质，你用于提取病毒了吗？
还是只提取了3.5万rpm的病毒沉淀
作者: 阿拉蕾 时间: 2011-9-24 09:24

没有，1万rpm离心下来的东西都弃去了
再有，如果你觉的病毒量太小，有人介绍液氮反复冻融的方法=================================
组织碎片和杂质，你用于提取病毒了吗？
还是只提取了3.5万rpm的病毒沉淀
作者: mod=8048 时间: 2011-9-24 09:24

好的,可是实验室没有液氮呀
我只能先研磨再均质然后多冻融几次
另外再用firnsnowjj的方法试试
作者: mod=8048 时间: 2011-9-24 09:24

好的,可是实验室没有液氮呀
我只能先研磨再均质然后多冻融几次
另外再用firnsnowjj的方法试试

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/) Powered by Discuz! 5.5.0