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标题: 【求助】PCR反应体系 [打印本页]

作者: join 时间: 2015-11-7 11:35 标题: 【求助】PCR反应体系

PCR反应体系中为什么有的加入二甲基亚砜?它能起到什么作用?

作者: zbboom 时间: 2015-11-7 11:36

QUOTE:

原帖由 join 于 2015-11-7 11:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

PCR反应体系中为什么有的加入二甲基亚砜?它能起到什么作用?

一般的PCR体系中不需要加入二甲基亚砜，但是有些PCR反应体系中加入二甲基亚砜，它作为一种辅助成分可以提高反应的特异性和产量。故又称为PCR反应的增强剂。
类似的辅助成分还有甘油、甲酰胺、牛血清白蛋白、PEG-6000等。
其加入量为：
甘油5-20%，
二甲基亚砜1-10%，
甲酰胺1.25-10%，
牛血清白蛋白10-100ug/ml，
PEG-6000 5-15%。
而且，有时候运用常规PCR扩增体系难以获得特异性产物，只有在有这些增强剂存在时才能扩增成功。
譬如说：当引物的G+C含量很高时，常规的PCR体系难以获得特异性产物，只有通过添加二甲基亚砜等PCR反应的增强剂才能成功的扩增出所需要的产物！！！！

作者: join 时间: 2015-11-7 11:36

多谢楼上我所做的实验PCR产物应该是两条条带,一条是对照条带320BP,另一条是特异性条带240BP. 可是我做了一周,结果只出现了对照产物,而没有出现特异性产物.而文献上写到PCR反应产物出现对照产物320BP时,说明反应体系适宜.请问楼上我的实验结果不好,它与我的反应体系中未加二甲基亚砜有关系吗?望回复.谢谢!

作者: zbboom 时间: 2015-11-7 11:36

这很难说哦！因为你的体系并没有给出来。
既然你是按照文献上做的，你可以加二甲基亚砜后跑一次，看有没有。如果还没有的话再考虑其它原因！
还有一种可能就是因为你的对照条带320BP,另一条是特异性条带240BP，它们在胶上可能根本就没有分开。
如果你的对照条带和特异性条带是在一管中跑的PCR的话，采用2％的胶，跑的时间加长，看有没有可能把它们分开。
如果你的对照条带和特异性条带不是在一管中跑的PCR，而是分开跑的，只是电泳时上样在一个点样孔中，那么可以重新跑次电泳，将目的条带和特异条带分开点样，这样也能判断目的条带出来没有！

作者: join 时间: 2015-11-7 11:37

多谢楼上,我想应该在电泳上跑开了,因为我在点样时加了MARKER.100BP为间隔的.100-600BP这六条带都出来了.但就是没有240BP的条带.下面附上我的PCR反应体系,望楼上能帮我指导指导.谢谢!!!

作者: join 时间: 2015-11-7 11:37

相关疾病：
46XX性发育睾丸疾病先天性卵巢发育不全综合征

我是学内分泌专业的,我的课题题目为<<PAI-1基因4G/5G多态性与糖尿病合并肾病的相关性研究>>.现在正在做PCR实验阶段，实验结果不理想。只有对照引物出现了条带，而4G和 5G引物没有出现条带。引物是根据文献合成的，上游对照引物 Tm 值是61.99；GC%是46.15；共同下游引物Tm值是66.00;GC%是70.00; 缺失型等位基因(4G)特异性引物Tm值是59.42;GC%是64.71; 插入型等位基因(5G)特异性引物Tm是61.83;GC%是70.59. 对照产物是320BP的，4G和5G的产物是240BP的.试了几天在Tm =67时出现需要的对照产物，并且条带亮度还可以.但是没出现4G和5G的产物.而且文献中写到出现对照产物320BP时,说明PCR反应体系最适宜.请楼上能帮忙分析一下，不胜感激！
我的PCR体系：模板DNA2μl,上游对照引物 0.3μl
共同下游引物 0.3μl,4G特异型引物0.3μl ,5G特异型引物0.3μl.(以上引物浓度为25UMOL/L)
Taq酶 0.2U
Taq buffer 2.5μl,MgCl2 1.3μl
DNTPs0.2μl
加水至25μl
94ºc 3m
94ºc 45s
67ºc 45s
72ºc 1m
35 cycles
72ºc 3m
郁闷中，急！

作者: join 时间: 2015-11-7 11:37

我的反应退火温度也用过58度的,引物也各加量到0.4UL.可是仍然没有特异性的反应产物,请您帮我分析一下.

作者: 白白的 时间: 2015-11-7 11:38

路过，随便说说：我也做过不少PCR，可是dNTP加的是你的十倍的量（2ul）。不知你的dNTP浓度是多少。

作者: join 时间: 2015-11-7 11:38

我的dNTP浓度是10mmol/l,我今天下午又做实验了.同时还加了ACE基因的上.下游引物作对照,结果是ACE反应产物490BP的条带出来了 ,可是PAI-1基因的条带还是没有出来.在两个反应体系中除了引物的量不一样,其他的量都是一样的 .不是是哪里的问题?还望能给予指点.谢谢!

作者: zbboom 时间: 2015-11-7 11:38

1. 如果你的反应体系是参照文献来做的，那最好也要加入二甲基亚砜，因为引物中G+C含量比较高，可能只有加入二甲基亚砜才能跑出目的基因。
2. 反应体系中引物的量和dNTP的量也是完全按照文献来做的吗？
个人认为下游共同引物的量不够，而且确实如楼上所说，你的dNTP的浓度未知，所以不知道你的dNTP量够不够。
3. 根据你的反应体系，你应该是跑的共管PCR，在没有跑出目的基因前，可现将各个目的基因与参照基因分开跑，等跑出目的基因后再寻找两者共同的适宜温度跑共管PCR。
4. 我们的反应体系如下，以供参考：
cDNA 3.0 µl为模板，依次加入去离子水 16.3µl，10×buffer 2.5µl，25mmol/L MgCl2 1.5µl，上游引物20µmol/L 0.5µl，下游引物20µmol/L 0.5µl，10 mmol/L dNTP 0.5µl，Taq酶（5u/µl）0.2µl构建25µl PCR反应体系。

作者: join 时间: 2015-11-7 11:38

正如楼上所说 1.我确实把下游引物加倍过,可是结果形成了大量的引物二聚体,还是没有特异性条带. 2.有的文献上也没加二甲基亚砜,我想应该能出来结果吧 3.我也曾经分管做了两次,可是同样出来引物二聚体,不知到底是啥原因? 4.至于底物的量 ,我加了0.2UL,出来过对照条带.文献上是0.5UL,您说与它有关系吗?有人专门做过底物梯度的实验,说是底物量大也不行.特请您帮忙参考,谢谢!!!

作者: 白白的 时间: 2015-11-7 11:39

既然以上这些你都注意过了.。
那就只有先单独跑目的条带，做一个退火温度的梯度。譬如说4G 的Tm 为59度，那就从54度开始，每2度跑一个梯度，直到跑出目的条带为止。大部分时候实际退火温度比提供的低，但是有些时候实际退火温度会比提供的高一些。所以具体的温度还是要通过梯度摸索！！
总之一句话，在没有单独跑出目的条带之前，最好不要跑共管PCR。免得既浪费了时间，又浪费了金钱。

作者: 白白的 时间: 2015-11-7 11:39

我帮你大体看了一下文献，
既然你的阳性对照能跑出来，证明你的模板、试剂应该都没有问题。
根据你的文献，在同一个样本中，4G和5G至少能跑出一个来，但是不能确定你手上现有的标本能跑出4G还是5G，所以只能够同时摸索退火温度。
建议：
用同一个样本的模板跑5管4G，5管5G，不要加内参照。另外再单独跑一管内参照作为此次的对照。内参的温度就按你以前跑的温度。共11管。
4G/5G的退火温度选择：60、62、64、66、68。
采用以下体系：
DNA 3.0 µl为模板，依次加入去离子水 16.3µl，
10×buffer 2.5µl，
25mmol/L MgCl2 1.5µl，
上游引物20µmol/L 0.5µl，
下游引物20µmol/L 0.5µl，
10 mmol/L dNTP 0.5µl，
Taq酶（5u/µl）0.2µl
构建25µl PCR反应体系
跑完后用1.5%的琼脂糖电泳，当指示剂跑过胶的一半时再看胶。
等你的好消息！！
PS：再给你个建议，可以使用天为时代的2×Taq MasterMix 混合体系跑PCR，只要再加入模板和引物即可，可减少操作误差，简化操作步骤！

作者: join 时间: 2015-11-7 11:40

那我4G/5G分别应该加多少呢?望指教.那您的意思是我总共做十五次PCR吗?因为我们这里PCR仪不能按温度梯度运行.望赐教!谢谢!!!

作者: 白白的 时间: 2015-11-7 11:42

不知你是怎么算出 15 次来的？
既然你那里没有梯度PCR仪，就分5次跑。不过这5次要使用同样的DNA模板，和试剂！！
第一次跑两管，一管只加 4G 的引物，另一管只加 5G 的引物。
退火温度设置为 60 度。其它的按照给你的体系加！！
至于引物的量，按照给你的浓度
上游引物20µmol/L 0.5µl，
下游引物20µmol/L 0.5µl，
换算。
另外四次也是每次跑两管，和第一次一样，只有退火温度不同，其它条件都是一样。第二次跑62度，第三次64，一直到第五次的68度。

作者: join 时间: 2015-11-7 11:45

首先说出我的肺腑之言,真得非常非常感谢您!!!能得到您的指点,我感到万分荣幸!因为这个课题纯粹是我自己查资料,自己定课题,自己做实验......我的导师是纯粹搞行政的;再者,我特别想把这个课题做成功,每天4G/5G反应产物都会出现在我的睡梦中,我不想放弃!万般无奈!我只有求助大家了.再次对帮助过我的人表示由衷的感谢!!! 其次,我想请教您一下,您说的一管只加4G引物,是什么意思呢?是不是在其中加入4G引物,共同下游引物,DNA模板,DNTP,酶,缓冲液,镁离子,去离子水只至体系达25UL?另一管就是把4G换成5G,其他一样,是这样的吗? 望赐教!谢谢!!!

作者: join 时间: 2015-11-7 11:45

谢谢您的及时回复!我今天又做实验了.每个标本分两管做,一个是4G管,另一个是5G管. 反应体系具体如下:上游引物0.3UL,共同下游引物0.3UL,4G引物0.3UL,(引物浓度为25UM/L),DNTP0.4UL,酶0.3,镁离子1.3UL,缓冲液2.5UL,加水至25UL;5G反应管加量与4G管一样. 实验结果:对照产物320BP条带特别好,实验老师说,这样的条带连20BP的间距都能分开.但是就是没有特异性条带. 并且前面还有剩余的引物,不知为何? 郁闷啊!!!望赐教

作者: 白白的 时间: 2015-11-7 11:46

QUOTE:

原帖由 join 于 2015-11-7 11:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢您的及时回复!我今天又做实验了.每个标本分两管做,一个是4G管,另一个是5G管. 反应体系具体如下:上游引物0.3UL,共同下游引物0.3UL,4G引物0.3UL,(引物浓度为25UM/L),DNTP0.4UL,酶0.3,镁离子1.3UL,缓冲液2.5UL,加 ...

为什么还会有对照产物出来，不是叫你不要加对照产物的引物么？？？？
你加的引物中：上游引物0.3UL,共同下游引物0.3UL,4G引物0.3UL 上游引物是什么的上游引物？？？？？不是叫你在反应体系中只加4G的上游引物和共同的下游引物么？？
还有，你用的4G的上游引物的序列是什么？？？能给出来么？

作者: join 时间: 2015-11-7 11:46

哦今天上午没来得及照您指点的去做,打算明天再按您说的去做.望见谅! 引物序列为：插入型等位基因（5G）特异性引物：5＇-GTCTGGACACGTGGGGG-3＇，缺失型等位基因（4G）特异性引物：5＇-GTCTGGACACGTGGGGA-3＇，共同的下游引物：5＇-GCTGTCCACCCGGTGCTCTG-3＇，上游对照引物：5＇-AAGCTTTTACCATGGTAACCCCTGGT-3＇。此引物序列来自昨日给您发的参考文献.
谢谢!!!

作者: join 时间: 2015-11-7 11:46

首先我要在此感谢白白的老师,在他的热情帮助下,我今天终于做出了实验应有的结果,结束了近半个月的噩梦般的生涯.这种心情是无法用语言来形容的!由衷地说一句话!太谢谢您了!!!(不管你年龄有多大).是您给了我在黑暗中勇往直前的信心!!!我一定会把您的精神发扬下去!!!

作者: join 时间: 2015-11-7 11:47

我今天按照您的吩咐分管做了,并且把退火温度调到62度,结果特异性条带出来了.今天没加上游对照引物,等我明天再分管加一个上游对照引物,等结果出来,我给您看看电泳结果.来共同享受一下咱们的努力结果!谢谢!!!

作者: join 时间: 2015-11-7 11:47

你好!我已给你把电泳结果发到你的邮箱里,请你抽空过目. 在电泳图中第一条条带为MARKER,其他每三条为一个标本,依次类推,共做了三个标本.其中在标本的三条条带中第一条检测4G基因,第二条检测5G基因,第三条是上游对照.今天用的退火温度仍为62度.希望您能给予宝贵意见!争取做出最满意的实验结果!!!谢谢!!!

作者: join 时间: 2015-11-7 11:47

请你有空看看我的今天实验的反应体系: 首先加入去离子水16.5UL,10成的缓冲液2.5UL,25UM/L镁离子1.5UL,下游引物25UM/L0.4UL,4G引物25UM/L0.4UL,10MM/LDNTP0.4UL,TAQE0.3UL.最后加入模板DNA3UL.总体系达25UL.其他5G.上游对照引物的加量与4G反应管一样. 请你帮我分析一下,是什么原因导致出现那么多的杂带?并且我该去如何改进呢?谢谢!

作者: 白白的 时间: 2015-11-7 11:48

你好!我已给你把电泳结果发到你的邮箱里,请你抽空过目. 在电泳图中第一条条带为MARKER,其他每三条为一个标本,依次类推,共做了三个标本.其中在标本的三条条带中第一条检测4G基因,第二条检测5G基因,第三条是上游对照.今天用的退火温度仍为62度.希望您能给予宝贵意见!争取做出最满意的实验结果!!!谢谢!!!

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刚刚看了你的电泳图（如下），内参照和4G的温度已经比较稳定了，但是5G的条带不稳定，第一个和第二个样本杂带比较多，但是第三个样本的5G 条带很好。
建议：
用62度重新跑一次第一和第二样本的5G ，如果还是没有稳定的目的条带，那就单独跑一个5G 的退火温度梯度（从60～68），比较一下那个温度条带最清楚！
至于下面的引物二聚体，暂时不要管他，等5G的退火温度稳定了之后在调整！
另：以后可以直接将电泳图贴到帖子上，也方便其它战友帮你出主意！！！
如何贴图请见：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=111&id=1399406&sty=1&tpg=1&age=0')
你的电泳图：

图片附件: 63480360.jpg (2015-11-7 11:48, 22.51 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=38536

作者: 白白的 时间: 2015-11-7 11:50

谢谢!你说是不是由于我的反应体系中加的TAG酶过量引起的杂带呢?望赐教!!!

作者: 白白的 时间: 2015-11-7 11:50

因为我的标本中4G和5G基因型出现的频率是随机的.意思是在第一个和第二个5G反应管中可以不出来条带.能不能把它单纯地看为过量引起的杂带呢?你说我能不能把酶量减少来看看呢?望指点!谢谢!!!

作者: 白白的 时间: 2015-11-7 11:50

一般情况下杂带的产生是由引物的退火温度引起的，与Taq酶的量没有关系。
所以建议还是先考虑退火温度！！
第一和第二个样本的5G 产物中，在240bp 的位置都有特异性条带，而且第二个样本的特异性条带还比较明显。其它条带是很明显的退火温度差异引起的杂带。
故优先考虑做退火梯度！

作者: join 时间: 2015-11-7 11:50

好的听兄弟一点,我也好象看到了240B P处的条带,正如老兄所说,可能就是由于退火温度引物的杂带,我明天遵照老兄指点,再专门做一下第一 .二个标本的5G基因型.太感谢了!又学了一招!

作者: join 时间: 2015-11-7 11:51

一下是小弟我今天的实验结果.前面的条带是MARKER,后面依次为昨日三个标本的5G引物出来的条带;今天用的退火温度是64度.望赐教!谢谢!

作者: join 时间: 2015-11-7 11:51

电泳结果如下

图片附件: 62948358.jpg (2015-11-7 11:51, 23.07 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=38537

作者: join 时间: 2015-11-7 11:51

相关疾病：
46XX性发育睾丸疾病先天性卵巢发育不全综合征
电泳结果如下

图片附件: 46455183.jpg (2015-11-7 11:51, 23.07 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=38538

作者: join 时间: 2015-11-7 11:52

第五个点样孔是第四个孔点样时不慎流进的 .

作者: 白白的 时间: 2015-11-7 11:52

第二个样本的杂带少了很多了。
继续做64度的退火！！
电泳时上样量减少，要不就把胶做厚一点！减少点样时的交叉污染。

作者: dog002 时间: 2015-11-7 11:52

请问酶的浓度不同,怎么确定剂量啊?如2U/UL和1U/UL的浓度时所用量是不是一样呢?

作者: join 时间: 2015-11-7 11:53

肯定是不一样的,我所用的TAQ酶浓度是5U/UL.慢慢摸摸量,别着急!会得到一个最适的量的.祝你好运!

作者: JK.jon 时间: 2015-11-7 11:53

我是一个刚进实验室的新手，目前正在做的课题是关于肺癌抑癌基因RASSF1A的甲基化，采用MSP的方法。根据参考文献合成了甲基化和非甲基化的两对引物，在年前的时候实验出现MSP特异性产物条带，结果很好。但后续的重复时，不是没有产物就是出现很多的非特异性条带，我也改动了我的实验体系和PCR条件，但都没有再出现理想的产物条带，很是郁闷，希望前辈高手能够指点指点，不胜感激！

作者: eor 时间: 2015-11-7 11:53

标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液　 10ul
4种dNTP混合物　各200umol/L
引物　　　　　各10～100pmol　
模板DNA 　　　　0.1～2ug　
Taq DNA聚合酶　 2.5u　
Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L
加双或三蒸水至　100ul
更多关于“PCR反应体系与反应条件”的信息可以查看cuturl('http://www.biomart.cn/experiment/430/457/458/15583.htm')

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