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标题: 【求助】ployA加尾法PCR U6引物加什么？ [打印本页]

作者: dotaaa 时间: 2015-11-7 11:54 标题: 【求助】ployA加尾法PCR U6引物加什么？

相关疾病：
白血病

各位老师，前辈，学生生首次做microRNA，遇到一个问题，特来求助。我做的是白血病细胞株的microRNA，首先用traka 的triziol 提取了细胞的总RNA，OD260/280 是1.83，浓度大概2.5ug/ul，用ployA加尾法做逆转录（也是traka的试剂盒 D035A），加尾和逆转录的过程是在一起的，没有加任何的特异引物，试剂盒有通用的逆转录引物，逆转录完成后就用染料法做定量，待测的microRNA用特异性的正向引物，反向引物也是试剂盒配的通用引物。内参选用U6，现在的问题是我的U6的引物应该只加正向引物然后反向用通用的引物吗？
实验的过程中发现待测的miRNA曲线都有出来，我的U6加特异性正向引物和通用反向引物，曲线跑不出来，当我改成U6加正反向都是U6的引物后就可以跑出来了，但是CT值一直不高，30以后。这是为什么？
还有一个问题是U6在ployA加尾的过程中应该也会一起加尾吧，按这个道理来说，U6也加尾了，我定量的时候应该是用特异性正向引物+通用反向引物的，为什么这样就跑不出来了？而改成特异性的下游引物后就可以跑出来了。
希望各位老师、前辈帮忙解答，**。
我的U6引物是：
U6-F ：5-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3
U6-R ：5-GTGCAGGGTCCGAGGT-3

作者: 乌贼老弟 时间: 2015-11-7 11:55

我用的U6引物序列是① U6snRNA F Primer 5‘ATTGGAACGATACAGAGAAGATT
② U6snRNA R Primer 5’ GGAACGCTTCACGAATTTG

作者: dotaaa 时间: 2015-11-7 11:55

上下游都加还是可以出来的，但是想不通，还没有来得及进一步看

作者: wanglaoshi 时间: 2015-11-7 11:56

你好，请问你的实验中待测的microRNA所用特异性的正向引物是如何设计的？

作者: dotaaa 时间: 2015-11-7 11:56

QUOTE:

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你好，请问你的实验中待测的microRNA所用特异性的正向引物是如何设计的？

因为序列比较短，我的基本上是按照原microRNA序列的，效果蛮好的。

作者: dotaaa 时间: 2015-11-7 11:56

和试剂公司探讨过只加上游，下游用通用的，

作者: 969 时间: 2015-11-7 11:57

QUOTE:

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因为序列比较短，我的基本上是按照原microRNA序列的，效果蛮好的。

我也是按照原microRNA序列设计的，但是用primer 5检测发现Tm值，二聚体，GC含量基本都不符合标准~~不知道你有没有这方面的经验？谢谢~~

作者: dotaaa 时间: 2015-11-7 11:57

5'端修饰一下呗这么短的序列没有什么好的办法，PCR的条件苛刻一点了说不定特异性会好一点，我也注意到你说的这些情况，但是没有管他，直接去跑了，没有想象中的糟糕，都还可以，有些有杂带的就估计是引物不好的原因（下面那个，考虑就是引物的原因，结果就不可靠了）

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作者: dotaaa 时间: 2015-11-7 11:58

我也是按照原microRNA序列设计的，但是用primer 5检测发现Tm值，二聚体，GC含量基本都不符合标准~~不知道你有没有这方面的经验？谢谢~~

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上面双峰的图可能就是引物不好引起来的

作者: hyuu 时间: 2015-11-7 11:58

你好，我也要做miRNA的染料法荧光定量，也打算用takara的试剂盒，但是对有些东西还不够了解，想请教一下。
1.逆转录时需要设计miRNA的茎环引物吗?看你上面的回复，好像用polyA法似乎不用合成茎环引物啊。用的是通用引物吗？
2.逆转录之后的PCR，这一步只需要设计特异性的上游引物就行了吗？下游引物也是通用的吗？
谢谢回复。

作者: dotaaa 时间: 2015-11-7 11:58

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你好，我也要做miRNA的染料法荧光定量，也打算用takara的试剂盒，但是对有些东西还不够了解，想请教一下。
1.逆转录时需要设计miRNA的茎环引物吗?看你上面的回复，好像用polyA法似乎不用合成茎环引物啊。用的是通用引物吗？
2. ...

1、有通用引物
2、对

作者: misswu61 时间: 2015-11-7 14:10

5'端修饰一下呗这么短的序列没有什么好的办法，PCR的条件苛刻一点了说不定特异性会好一点，我也注意到你说的这些情况，但是没有管他，直接去跑了，没有想象中的糟糕，都还可以，有些有杂带的就估计是引物不好的原因（下面那个，考虑就是引物的原因，结果就不可靠了）

。
......

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一开始设计的时候我直接用的miRNA成熟序列，没有考虑Tm值，二聚体，GC含量这些问题，但是后来跑出来不太好，后来问了公司说是设计的问题，另外我做的是血浆，不知道样本是不是也有很大的影响因素，现在在用组织做，希望会有好结果~~谢谢你的答复~~

作者: xiaoxiaoniao 时间: 2015-11-7 14:11

U6还是加的特异性引物才能跑出来么，还是只加了上游引物?

作者: wawa 时间: 2015-11-7 14:13

只加上游

作者: vera+ 时间: 2015-11-7 14:15

加通用引物，应该能跑出来。你的上下游引物Tm值平衡了吗？TaKaRa的通用引物Tm好像是65°C吧，会是你的U6正向引物和通用引物形成二聚体了吗？
话说，你用特异下游引物应该也可以吧，也就是个内参，保持每孔一致就可以了吧？

作者: dotaaa 时间: 2015-11-7 14:16

加通用引物，应该能跑出来。你的上下游引物Tm值平衡了吗？TaKaRa的通用引物Tm好像是65°C吧，会是你的U6正向引物和通用引物形成二聚体了吗？
话说，你用特异下游引物应该也可以吧，也就是个内参，保持每孔一致就可以了吧？

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嗯后面用别人的内参做了就可以了谢谢

作者: idea2011 时间: 2015-11-7 14:17

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加通用引物，应该能跑出来。你的上下游引物Tm值平衡了吗？TaKaRa的通用引物Tm好像是65°C吧，会是你的U6正向引物和通用引物形成二聚体了吗？
话说，你用特异下游引物应该也可以吧，也就是个内参，保持每孔一致就可以了吧？

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麻烦前辈告知一下你用的内参上游引物序列吧，我今天用了一个U6上游跑了一下也是出现双峰。

作者: dotaaa 时间: 2015-11-7 14:18

我自己的跑的也不好，你看楼上提供的是否可用

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U6引物序列是① U6snRNA F Primer 5‘ATTGGAACGATACAGAGAAGATT
② U6snRNA R Primer 5’ GGAACGCTTCACGAATTTG

作者: 8s5g 时间: 2015-11-7 14:18

你好，请问上游引物的修饰是两端都可以吗？是只能删减还是可以适当增加一些碱基序列？可以增加的话是在哪一端？因为有些Mir序列里面GC比太低或者太高了。从文献上查到的一些上游引物序列的TM值只有53℃，但是通用的下游引物却是60℃，那反应的延伸温度没有关系吗？麻烦你了m(_ _)m

作者: dotaaa 时间: 2015-11-7 14:19

你好，请问上游引物的修饰是两端都可以吗？是只能删减还是可以适当增加一些碱基序列？可以增加的话是在哪一端？因为有些Mir序列里面GC比太低或者太高了。从文献上查到的一些上游引物序列的TM值只有53℃，但是通用的下游引物却是60℃，那反应的延伸温度没有关系吗？麻烦你了m(_ _)m

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5'端修饰，可以先跑一下看，一般跑的出来

作者: 8s5g 时间: 2015-11-7 14:20

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你好，请问上游引物的修饰是两端都可以吗？是只能删减还是可以适当增加一些碱基序列？可以增加的话是在哪一端？因为有些Mir序列里面GC比太低或者太高了。从文献上查到的一些上游引物序列的TM值只有53℃，但是通用的下游引物却 ...

不好意思，最近没上来逛园子。请问正向引物设计以后要怎么放去BLAST？之前的时候没有考虑到这个问题。常规的BLAST方法验证不了。如果只是把正向引物放进mir序列的比对的话结果惨不忍睹

作者: summerxx 时间: 2015-11-7 14:21

嗯后面用别人的内参做了就可以了谢谢

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请问，您后面是用U6的上下游特异性引物做的吗？还是只加了上游引物？
如果是上下游特异性引物，在反转录的时候应该加U6的特异性RT引物吗?
谢谢

作者: summerxx 时间: 2015-11-7 14:21

我用的U6引物序列是① U6snRNA F Primer 5‘ATTGGAACGATACAGAGAAGATT
② U6snRNA R Primer 5’ GGAACGCTTCACGAATTTG

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您是用加尾法吗？反转的时候是用通用引物，还是R Primer？跑realtime 的时候是加F和R primer吗，还是F 和通用引物？
谢谢

作者: dotaaa 时间: 2015-11-7 14:22

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我用的U6引物序列是① U6snRNA F Primer 5‘ATTGGAACGATACAGAGAAGATT
② U6snRNA R Primer 5’ GGAACGCTTCACGAATTTG

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加尾法逆转录的，跑的定量，反向是通用引物，由试剂盒提供了

作者: Darcy 时间: 2015-11-7 14:24

加尾法逆转录的，跑的定量，反向是通用引物，由试剂盒提供了

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那您的U6的F Primer是自己设计的吗？还是从公司买的？

作者: dotaaa 时间: 2015-11-7 14:30

那您的U6的F Primer是自己设计的吗？还是从公司买的？

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自己设计

作者: moonlight 时间: 2015-11-7 14:30

我也和你一样不过我后来用的是U6的FR 没有用试剂盒的可以跑出来如果用试剂盒的通用引物好像跑的不好诶。你是否能给出你修饰之后的U6F序列参考一下？

作者: dotaaa 时间: 2015-11-7 14:31

我也和你一样不过我后来用的是U6的FR 没有用试剂盒的可以跑出来如果用试剂盒的通用引物好像跑的不好诶。你是否能给出你修饰之后的U6F序列参考一下？

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自从梁上君子光临我们寝室一次以后我所有的东西都被他带走了，往后的问题回答不了了

作者: whitesheep 时间: 2015-11-7 14:34

加尾法只加上游引物，下游用通用的。不过加尾法的u6和茎环的u6是不一样的，有现在成的商品化的，直接买来用就行了。

作者: dotaaa 时间: 2015-11-7 14:35

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加尾法只加上游引物，下游用通用的。不过加尾法的u6和茎环的u6是不一样的，有现在成的商品化的，直接买来用就行了。

是的谢谢。顺便请教一下战友。普通PCR的内参引物长度270bp 用来做荧光定量PCR（染料法）的内参测出CT值13~14 而我的母的基因CT值都是25~29 40个循环，这样的数据可以用吗？

作者: 大尾巴 时间: 2015-11-7 14:36

加尾法只加上游引物，下游用通用的。不过加尾法的u6和茎环的u6是不一样的，有现在成的商品化的，直接买来用就行了。

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两种方法你可以选择用同样的u6，并不是不一样，主要是看你怎么选择

作者: 大尾巴 时间: 2015-11-7 14:38

是的谢谢。顺便请教一下战友。普通PCR的内参引物长度270bp 用来做荧光定量PCR（染料法）的内参测出CT值13~14 而我的母的基因CT值都是25~29 40个循环，这样的数据可以用吗？

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普通pcr是指扩增mRNA的cDNA？如果是，270bp的片段长度稍微有点长，太长的序列无法保证扩增效率达到最佳状态也就是100%
排除以上问题，你的数据是可以使用的，说明你目的基因表达相对较低

作者: yayya 时间: 2015-11-7 14:38

你好，我最近也要做microRNA 的荧光定量，小白一个，有几个问题我想问一下：
1.我看你用takara的试剂盒加尾ployA，是不是试剂盒里就有的ployA，还是这个要自己买的，
2.035A这个试剂盒有通用的引物包含在里面吗？
3.我在网上没有找到通用引物的序列，好像不一样的公司提供的microRNA反转录的试剂盒用的序列都不跟我们说，我们用的反向引物怎么设计呢？还是直接买公司的反向引物，
不胜感激啊

作者: dotaaa 时间: 2015-11-7 14:39

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你好，我最近也要做microRNA 的荧光定量，小白一个，有几个问题我想问一下：
1.我看你用takara的试剂盒加尾ployA，是不是试剂盒里就有的ployA，还是这个要自己买的，
2.035A这个试剂盒有通用的引物包含在里面吗？
3.我在网上没有找 ...

呵呵
1、有ployA的逆转录试剂盒
2、035a好像是有通用试剂盒的你可以在宝生物公司的网站里检索到试剂盒说明书，网页版是有中文的书的
3、通用引物序列是没有提供的你如果想知道，可以送一点去测序

作者: Darcy 时间: 2015-11-7 14:39

能否把大鼠RNU6B序列给我发一下，做的比较好的，下游通用引物我自己有。

作者: ns5fan 时间: 2015-11-7 14:40

是的谢谢。顺便请教一下战友。普通PCR的内参引物长度270bp 用来做荧光定量PCR（染料法）的内参测出CT值13~14 而我的母的基因CT值都是25~29 40个循环，这样的数据可以用吗？

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我认为可以，还请高手进一步详解。

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