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标题: 【求助】基因组DNA提取 [打印本页]

作者: iii_ii 时间: 2015-11-11 16:41 标题: 【求助】基因组DNA提取

郁闷之极，昨天使用TAKARA的试剂盒提取EDTA抗凝血的全基因组DNA后，用分光光度计检测居然和空白对照的结果一样，下面我把相关的情况说一下，希望各位高手能够帮我找找原因。
1.我的血标本保存时间比较长，是在采血后于4度保存了一个星期，然后放置-20度左右冻存了2个月；
2.使用的是takara试剂盒，其中有几步离心的步骤，由于准备不充分，在离心后放置了10-20分钟再进行后续的步骤
3.70％乙醇是临时急配的
4.溶解DNA的是双蒸水
5.提取完毕后溶解之前，我在离心管底感觉隐约是能看到一点沉淀的

作者: 3.14 时间: 2015-11-11 16:41

跑个电泳看一下吧
估计是降解了

作者: iii_ii 时间: 2015-11-11 16:41

我是溶解之后马上就去分光光度计检测的，应该没那么快降解吧

作者: seagate 时间: 2015-11-11 16:42

可能是提取的效益不高,讲解也是一部份,但是我以前用过陆桥公司的磁珠提取血基因,100ul血放了很久的,都可以提到,跑电泳清晰看的到

作者: redbutterfly 时间: 2015-11-11 16:42

如果DNA没有完全溶解也可能会出现这种情况，提取的DNA 加水以后4度溶解1到2天再检测

作者: iii_ii 时间: 2015-11-11 16:42

我提取完毕后立即加双蒸水溶解，没有4度过夜，因为这个会出现溶解不完全吗？
takara的说明书上也没有提到要4度溶解一定时间，只提到“提取后的DNA，请用TE溶解，溶解后的DNA冷冻或4度保存都可以。但如果用灭菌蒸馏水溶解，请务必冷冻保存，以防止DNA分解”

作者: yizhi 时间: 2015-11-11 16:43

不要4度要室温
dna很稳定
分光计是看不出降解的
降解是在你保存血液或是在提取过程中
不是溶解

作者: TAT 时间: 2015-11-11 16:43

关键是你抽提的过程。

作者: okhaha 时间: 2015-11-11 16:43

应该是基因组DNA没有提取出来吧，你做好充分的准备重新提一下试试，换成TE溶解DNA样品。

作者: 04906 时间: 2015-11-11 16:43

我也是用的这个试剂盒，一般情况都能看到沉淀，但是测浓度时很低，有的只有30ugml

作者: eve_49 时间: 2015-11-11 16:46

郁闷之极，昨天使用TAKARA的试剂盒提取EDTA抗凝血的全基因组DNA后，用分光光度计检测居然和空白对照的结果一样，下面我把相关的情况说一下，希望各位高手能够帮我找找原因。
1.我的血标本保存时间比较长，是在采血后于4度保存了一个星期，然后放置-20度左右冻存了2个月；
2.使用的是takara试剂盒，其中有几步离心的步骤，由于准备不充分，在离心后放置了10-20分钟再进行后续的步骤
3.70％乙醇是临时急配的
4.溶解DNA的是双蒸水
5.提取完毕后溶解之前，我在离心管底感觉隐约是能看到一点沉淀的
......

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1. 保存时间：4度1周，-20度两个月的保存时间算是短的了，而且不会对质量有致命的影响。而且就有些方法而言，冻存一段时间的血液提取起来更方便一些。-30度下保存了3年的血我们提取的效果也还不错。
2.试剂盒的选择：我看了Takara的试剂盒的操作说明，结合我们现在经常用的一些试剂盒，感觉就是怎么这么憋屈！呵呵！一次性处理的血量少不说，还得那么小心翼翼的，郁闷啊，打死偶也不会用这种盒子。推荐Promega的A1120或A1125，原理和Takara的类似，操作无需小心谨慎，我可以免费提供改良版的操作说明，一次可以处理冻存血600-750ul、新鲜血500ul，成功率近乎100%，60ul溶解后的浓度在100-300ng/ul，1.7-1.9之间。或者可以选择过柱子的试剂盒，MN、Qiagen什么的都可以，看你有多少钱了，只是产量低一些。
3.实验过程中有断档，对人血DNA提取来说一般不会有太大的影响，我们经常在加完溶液2后去休息一会，呵呵。当然试剂盒本身决定的。
4.DNA沉淀溶解的溶剂最好用1*TE，pH8.0，利于溶解，而且利于长期保存。双蒸水就不推荐了，问题多多。
5.沉淀能看到的话，那就不算太少了，60ul溶解完全的话，估计在30-50ng/ul。这样的最好用40ul去溶解。我们自己提取时，沉淀大小通常在0.5-1平方毫米左右的面积。
6.对于提血试剂盒，不要拘泥于它的操作说明中的量，有时候里面给的太保守了。

作者: feixi 时间: 2015-11-11 16:46

我提的可是冻了半年的血，试用了两个厂家的试剂盒，发现结果都不太好，而且还挺烦琐的，然后就用了二氧化硅法来提，俗称玻璃奶法，效果还不错，你可以试试！

作者: 了了 时间: 2015-11-11 16:46

耽误了一个多月，昨天再次去提DNA 。提取完毕后，在管底可以清晰看到沉淀，加入灭菌水后发现很难溶解，吹打了半天还是能隐约看到絮状的物质，于是只好放4度过夜，今天再去看结果。
看到众位的高见后，发现有提议孵育一段时间促进溶解，但温度不同，有55度、65度、室温还有4度。都不知道该如何选择了。

作者: iii_ii 时间: 2015-11-11 16:46

另外，我能看到沉淀，但是很难溶解，我分析原因可能有：1.干燥时间过长，我用乙醇清洗后，倒去乙醇，室温下倒置了十几分钟，虽然管壁上还残留一点乙醇，但管底可能干燥过度了。
2.混有蛋白质等杂质，影响溶解。

作者: iii_ii 时间: 2015-11-11 16:47

DNA放在4度估计放了24小时，下午过去看，还有一管里能清晰的看到絮状物。我选了两管用分光光度计测了一下，其中一管OD260为0.3312，OD260/OD280为1.0539，另一管OD260才0.001左右（稀释倍数为50倍），再测一次，两管的结果OD260都只有0.003左右了。于是我把DNA放进55度水浴锅中，并不时吹打，之后再去测，发现原先0.001的那管，OD260达到0.3531，OD260/OD280为1.3578，而其他的还是维持原状。后天再去跑电泳看看。
各位高人有何高见啊？

作者: ujne 时间: 2015-11-11 16:47

DNA我无论是用酚氯仿提取，还是试剂盒提，都是让提好的DNA 4度过夜充分溶解，有时候要放几天，然后跑个琼脂糖电泳看看。有时都直接做PCR，能扩增出来就是好的，不去管OD值。

作者: iii_ii 时间: 2015-11-11 16:47

DNA我无论是用酚氯仿提取，还是试剂盒提，都是让提好的DNA 4度过夜充分溶解，有时候要放几天，然后跑个琼脂糖电泳看看。有时都直接做PCR，能扩增出来就是好的，不去管OD值。

作者: pore 时间: 2015-11-11 16:48

耽误了一个多月，昨天再次去提DNA 。提取完毕后，在管底可以清晰看到沉淀，加入灭菌水后发现很难溶解，吹打了半天还是能隐约看到絮状的物质，于是只好放4度过夜，今天再去看结果。
看到众位的高见后，发现有提议孵育一段时间促进溶解，但温度不同，有55度、65度、室温还有4度。都不知道该如何选择了。
我是刚开始做PCR的新手，针对你上面提出来的问题，我建议你在55度的水浴箱中孵育30分钟左右吧，当你看到絮状物基本消失时再进行下一步操作就行。我自己做的效果还可以。

作者: 04906 时间: 2015-11-11 16:48

不知道你是用的什么离心机？当初我提不出来是用的国产小的离心机，转子半径太小了。换个大离心机，转数大一些，时间长一点。应该能提取出来。按要求，可以看到少量的DNA沉淀，吹打溶解的时候注意别沾在枪头上了。建议别用分光光度计测浓度，现有低灵敏度的不行。跑个胶看看就行了。一般差不多，当然要看你下一步做什么了。

作者: iii_ii 时间: 2015-11-11 16:48

我用的是比较大半径的离心机，转速跳到13000rpm。我提取的过程中有一次在异丙醇洗涤后弃上清时就看到絮状DNA被洗起来了，幸好发现，才没被吸掉。
我在考虑，以后弃上清时是不是可以不要弃的太干净，这样可以最大程度的避免丢失。

作者: iii_ii 时间: 2015-11-11 16:49

试剂盒的费用太高，我想试用一下KI法
提取步骤如下：
1、取EDTA2Na2 抗凝血200μl , 加入到1.5 ml Ep管中,加1.0 ml无菌重蒸水, 10 000 r /min离心3 min,弃上清;
2、加5 mol/L KI溶液40μl,旋涡振荡混合30 s。再加0.9%NaCl溶液100 μl, 氯仿/异戊醇( 24 ∶1,v/ v)混合液150μl,振荡混合30 s。10 000 r /min离心5 min,吸取200μl上清液,转移到另一个Ep管中；
3、加异丙醇120μl,轻轻混匀, 10 000 r/min离心5 min,弃上清。
4、加无水乙醇1.0 ml, 10 000 r/min离心5 min。弃去无水乙醇。加50μl无菌重蒸水使其溶解, - 20℃保存备用。
在加入异丙醇和乙醇后均未见沉淀，电泳也未见条带，求助大家可能是在哪一步出了问题。
另外，我还有一部分血标本，4度放置一周后－20度保存半年，用KI法提取可以吗？

作者: 66+77 时间: 2015-11-11 16:49

孵育一段时间促进溶解 65 度

作者: ladyhuahua 时间: 2015-11-11 16:49

我觉得是这样的,由于陈旧血样的白细胞破碎比较严重点,所以必须使用全血来提取,但是大部分的试剂盒在提取血基因组时.实际上有一般去除红细胞,离心获得白细胞过程,而白细胞本来就讲解不少,导致最后提取的量很少,一般建议直接采用血液来提取,而全血基因组包括两部分,一部分是白细胞破碎释放的基因组(虽然有点讲解),另一部分是为破碎的白细胞的基因组,所以得率更高

作者: qhyu 时间: 2015-11-11 16:50

1. 保存时间：4度1周，-20度两个月的保存时间算是短的了，而且不会对质量有致命的影响。而且就有些方法而言，冻存一段时间的血液提取起来更方便一些。-30度下保存了3年的血我们提取的效果也还不错。
2.试剂盒的选择：我看了Takara的试剂盒的操作说明，结合我们现在经常用的一些试剂盒，感觉就是怎么这么憋屈！呵呵！一次性处理的血量少不说，还得那么小心翼翼的，郁闷啊，打死偶也不会用这种盒子。推荐Promega的A1120或A1125，原理和Takara的类似，操作无需小心谨慎，我可以免费提供改良版的操作说明，一次可以处理冻存血600-750ul、新鲜血500ul，成功率近乎100%，60ul溶解后的浓度在100-300ng/ul，1.7-1.9之间。或者可以选择过柱子的试剂盒，MN、Qiagen什么的都可以，看你有多少钱了，只是产量低一些。
3.实验过程中有断档，对人血DNA提取来说一般不会有太大的影响，我们经常在加完溶液2后去休息一会，呵呵。当然试剂盒本身决定的。
4.DNA沉淀溶解的溶剂最好用1*TE，pH8.0，利于溶解，而且利于长期保存。双蒸水就不推荐了，问题多多。
5.沉淀能看到的话，那就不算太少了，60ul溶解完全的话，估计在30-50ng/ul。这样的最好用40ul去溶解。我们自己提取时，沉淀大小通常在0.5-1平方毫米左右的面积。
6.对于提血试剂盒，不要拘泥于它的操作说明中的量，有时候里面给的太保守了。
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这位战友，你好，我也是用Promega的A1125提取DNA，但我用的是冻存了近半年的全血，所以DNA含量较低，只有35ug/ml左右，我请问你：用此试剂盒时，最后一步加DNA再水化液可否只加60ul以提高DNA浓度，此外，能否把你“改良版的操作说明”发给我一份呢？我在站里给你发短信了，谢谢！

作者: xuuuu 时间: 2015-11-11 16:50

战友们，我想问一下你们血液标本的保存方法是从哪得来的。我查了好多文献都没有具体说明。

作者: 555444 时间: 2015-11-11 16:50

发一些方法供大家参考，附件可以下载，保存-20到-80都可以，3年以内都能提取，非抗凝血也能提取!但是如果要提取RNA就严格多了，采血时立马加入3倍体积的TRIPURE LS，才能保证RNA的质量，参考方法介绍cuturl('http://www.ebiotrade.com/newsf/2009-5/2009515134112578.htm')

作者: duchy 时间: 2015-11-11 16:51

1. 保存时间：4度1周，-20度两个月的保存时间算是短的了，而且不会对质量有致命的影响。而且就有些方法而言，冻存一段时间的血液提取起来更方便一些。-30度下保存了3年的血我们提取的效果也还不错。
2.试剂盒的选择：我看了Takara的试剂盒的操作说明，结合我们现在经常用的一些试剂盒，感觉就是怎么这么憋屈！呵呵！一次性处理的血量少不说，还得那么小心翼翼的，郁闷啊，打死偶也不会用这种盒子。推荐Promega的A1120或A1125，原理和Takara的类似，操作无需小心谨慎，我可以免费提供改良版的操作说明，一次可以处理冻存血600-750ul、新鲜血500ul，成功率近乎100%，60ul溶解后的浓度在100-300ng/ul，1.7-1.9之间。或者可以选择过柱子的试剂盒，MN、Qiagen什么的都可以，看你有多少钱了，只是产量低一些。
3.实验过程中有断档，对人血DNA提取来说一般不会有太大的影响，我们经常在加完溶液2后去休息一会，呵呵。当然试剂盒本身决定的。
4.DNA沉淀溶解的溶剂最好用1*TE，pH8.0，利于溶解，而且利于长期保存。双蒸水就不推荐了，问题多多。
5.沉淀能看到的话，那就不算太少了，60ul溶解完全的话，估计在30-50ng/ul。这样的最好用40ul去溶解。我们自己提取时，沉淀大小通常在0.5-1平方毫米左右的面积。
6.对于提血试剂盒，不要拘泥于它的操作说明中的量，有时候里面给的太保守了。
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总算见到你这个参与提取血液DNA十几万份的大神了！

作者: summerxx 时间: 2015-11-11 16:52

用试剂盒提血液里的DNA有的时候不能太过于细心，其实提取血液中的DNA直接用酚氯仿抽屉就可以了

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