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标题: 【求助】用CM-H2DCFDA探针测ROS [打印本页]

作者: #甜# 时间: 2015-11-14 16:15 标题: 【求助】用CM-H2DCFDA探针测ROS

想问一下大家用来测ROS的探针：CM-H2DCFDA，是在哪个公司买的（进口），货号是多少，谢谢。注：我是测活细胞内的ROS。

作者: vera+ 时间: 2015-11-14 16:16

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原帖由 #甜# 于 2015-11-14 16:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

想问一下大家用来测ROS的探针：CM-H2DCFDA，是在哪个公司买的（进口），货号是多少，谢谢。注：我是测活细胞内的ROS。

请问您最后用的这个试剂，还是试剂盒？推荐一下吧。。感谢感谢

作者: #甜# 时间: 2015-11-14 16:16

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请问您最后用的这个试剂，还是试剂盒？推荐一下吧。。感谢感谢

我用的是sigma的，货号是D6883(50MG).你也可以选择试剂盒，具体哪家的我没用过，也不是很清楚。反正就那几家，你自己再选择吧。

作者: vera+ 时间: 2015-11-14 16:17

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我用的是sigma的，货号是D6883(50MG).你也可以选择试剂盒，具体哪家的我没用过，也不是很清楚。反正就那几家，你自己再选择吧。

您好。我买的就是这个粉剂。
1、看论坛上有的说用DEMO或是PBS溶解，看您以前的帖子是用无水乙醇溶的，到底该用哪个溶比较好呢？
2、我是到半小时路程的地方测流式。看您的帖子是先染好色，然后到流式的地方，再洗几遍之后上机。我想的是，能不能把全部步骤做完，装到上流式的管子中，然后冰浴密封拿到流式细胞仪的地方直接上机观测，这样行不行呢？
3、能不能把您用这个粉剂测活性氧的详细操作步骤分享一下呢？太麻烦您了。十分感谢！

作者: #甜# 时间: 2015-11-14 16:17

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您好。我买的就是这个粉剂。
1、看论坛上有的说用DEMO或是PBS溶解，看您以前的帖子是用无水乙醇溶的，到底该用哪个溶比较好呢？
2、我是到半小时路程的地方测流式。看您的帖子是先染好色，然后到流式的地方，再洗几遍之后上机 ...

1.恩，我是看说明书上建议纯乙醇溶的，DMSO肯定也是可以溶的，这个应该没什么好比较的吧。看你其它溶剂是用什么溶的，少做一次溶剂对照组。
2.如果用流式的话，最好是染好就直接上机检测，如果时间太长会影响结果。不建议你全部弄好再带过去检测。
3.其实详细步骤也没什么，我是参考书上的：
1）收集细胞：取对数生长期细胞收集细胞并调整细胞浓度至（1～10）×106/mL（每个实验所需的细胞都不一样，可以自行调整）
（2）加入药物培养（也就是造模）
（3）装载探针：加入终浓度为10uM的DCFH-DA，37 °С 5 % CO2培养箱中静置0.5 h，每隔3-5min混匀一下，使探针和细胞充分作用。
（4）用无血清的培养基或温暖的PBS液洗涤细胞3次，去除未进入细胞内的DCFH-DA。
（5）收获各组细胞，上流失细胞仪检测ROS。激发光488nm，发射光 525nm
（6）实验分四组：细胞(空白对照组)、细胞+DCFH-DA(正常组)、细胞+DCFH-DA+药物（实验组），根据情况设计实验分组。其中空白对照组是用来排除细胞自身是否会有荧光；正常组是用来检测正常情况下的数值（因氧化反应是机体必需反应之一）；实验组是用来检测药物处理后数值的变化，从而推出药物是减少氧化损伤还是促进氧化损伤。

作者: vera+ 时间: 2015-11-14 16:18

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1.恩，我是看说明书上建议纯乙醇溶的，DMSO肯定也是可以溶的，这个应该没什么好比较的吧。看你其它溶剂是用什么溶的，少做一次溶剂对照组。
2.如果用流式的话，最好是染好就直接上机检测，如果时间太长会影响结果。不建议你全部 ...

请问，最后是看平均荧光强度吧，那么用winNDI 软件打开的结果图，是不是GMean 就代表平均荧光强度啊？焦急啊焦急。。。。万分感谢。

作者: vera+ 时间: 2015-11-14 16:18

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请教您一下，流式测ROS，用WINMDI软件分析结果，用直方图的形式打开实验结果，直接看stats里的GMean值就行吗？还是需要圈定一部分细胞设门？怎么设呢？
急切求助啊，谢谢您！

作者: #甜# 时间: 2015-11-14 16:18

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请教您一下，流式测ROS，用WINMDI软件分析结果，用直方图的形式打开实验结果，直接看stats里的GMean值就行吗？还是需要圈定一部分细胞设门？怎么设呢？
急切求助啊，谢谢您！ ...

直接看GMean值也可以的，因为你检测的时候细胞数以统一了。

作者: flower@@ 时间: 2015-11-14 16:19

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你好，我也想做ROS测定实验，可以向你请教吗？

作者: seven7 时间: 2015-11-14 16:20

您好，我想请问一下，我测量ros，结果用的Mean值，但审稿人提问what intensity the gating was done to quantify ROS？不知该怎么回答。急切求助啊，谢谢您！

作者: seven7 时间: 2015-11-14 16:20

直接看GMean值也可以的，因为你检测的时候细胞数以统一了。

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您好，我想请问一下，我测量ros，结果用的Mean值，但审稿人提问what intensity the gating was done to quantify ROS？不知该怎么回答。急切求助啊，谢谢您

作者: ladyhuahua 时间: 2015-11-14 16:20

您好，我想请问一下，我测量ros，结果用的Mean值，但审稿人提问what intensity the gating was done to quantify ROS？不知该怎么回答。急切求助啊，谢谢您

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记得我在哪里看见过也是一个人说审稿被打回来说的类似的话好像是说这个办法不能定量只能定性啥的
你在园子里搜一搜应该搜得到的

作者: bojitu 时间: 2015-11-14 16:21

麻烦问一下，Stock液在-20能放多久呢，还有把样品处理好之后到上机检测前，这之间最长的时间间隔可以是多久呢？谢谢

作者: #甜# 时间: 2015-11-14 16:21

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麻烦问一下，Stock液在-20能放多久呢，还有把样品处理好之后到上机检测前，这之间最长的时间间隔可以是多久呢？谢谢

我只放了一个月，最长我也不是很清楚了。

作者: mamamiya 时间: 2015-11-14 16:21

我想问下，试剂配好以后需要过滤再用吗？

作者: #甜# 时间: 2015-11-14 16:22

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我想问下，试剂配好以后需要过滤再用吗？

有条件最好过滤下。

作者: mamamiya 时间: 2015-11-14 16:22

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有条件最好过滤下。

如果用DMSO溶的话，还需要过滤吗

作者: #甜# 时间: 2015-11-14 16:23

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原帖由 mamamiya 于 2015-11-14 16:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

如果用DMSO溶的话，还需要过滤吗

是的。

作者: dreaming 时间: 2015-11-14 16:23

也在做ROS，用H2O2处理了细胞以后找能增强ROS的浓度。用FACS做了3次，发现浓度增加 Y轴反倒向左移，而且control组，没加H2O2的数值很高啊请问有没有人遇到过这样的情况。求分析原因！～
试验方法是：先在没有FBS的培养基里面贴细胞过夜，第二天用0，10，100，500，1000nM的H2O2处理2小时，然后用10nM DCFH-DA孵育30mins, PBS洗三遍，消化细胞，上机。

作者: cocacola 时间: 2015-11-14 16:23

学长你好。我最近做细胞活性氧实验，直接荧光显微镜观察，但发现对照和药物处理组在荧光下基本呈现一样的状态，都是特别特别亮，等了1.5min后都降为较为暗淡的绿色，我用的是sigma的D6883，DMSO溶解，工作浓度试过10uM，5uM，2.5uM，对照组与药物组都没有区别，染液工作30min，之后PBS洗3次，苦恼很久没有答案，请学长帮忙解答一下吧。

作者: bling 时间: 2015-11-14 16:25

您好！我的活性氧染色实验正常了，提高了一下细胞浓度，其他操作没有任何变化。虽然不知道是否与之前细胞数较少有关，但这一次实验成功了，打算以后就按照这一次方法做了，多谢！

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