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标题: 【求助】24孔板如何能铺得更均匀？ [打印本页]

作者: 吉吉0120 时间: 2015-11-14 21:25 标题: 【求助】24孔板如何能铺得更均匀？

最近铺了两张231细胞的24孔板，发现每个孔都是中间有一堆细胞聚集，周围的比较稀疏，这样会影响我后面的实验，请教如何使24孔板能铺得更均匀些？

作者: seagate 时间: 2015-11-14 21:26

我用的96孔板一开始也有这样的问题别人教了我一种方法试了试还不错先在板内铺一点血清再加细胞悬液进去这样细胞会比较分散如果对每个孔的细胞数有所要求乘以相应倍数就可以了

作者: 吉吉0120 时间: 2015-11-14 21:28

多谢楼上的战友，但是我想96孔的滴上血清或许有用，但对于24孔的恐怕不会起太大作用吧。有没有关于24孔的方法呢？

作者: 吉吉0120 时间: 2015-11-14 21:29

首先，消化不要过头或者不足。
消化后，不论是用hank's液还是培养基洗细胞，都要先用含5%血清的培养基终止消化。
简单说94用小牛血清里滴蛋白，保护住消化造成的细胞膜损伤，避免发生细胞自我修复。

作者: lagua123 时间: 2015-11-14 21:29

你可以先放在超净台里面放上一段时间，等全部沉积在在底部以后转移至培养箱中。
或者你直接放到培养箱中，等细胞沉积下去，则轻拍培养板使细胞重悬，然后再等贴壁重复一次。
我觉着随着板空孔径越大，此类现象越严重。不知道是不是因为孔中培养基温度不均一造成的？

作者: dmg 时间: 2015-11-14 21:29

你把细胞铺板后以十字架的方式上下左右晃动，然后轻轻放入培养箱就可以了

作者: eric930 时间: 2015-11-14 21:32

QUOTE:

原帖由 dmg 于 2015-11-14 21:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你把细胞铺板后以十字架的方式上下左右晃动，然后轻轻放入培养箱就可以了

这个才是解决此类问题的正确方法。关于此问题在论坛里已经有好多讨论了，稍微搜索一下就会有很多

作者: ladyhuahua 时间: 2015-11-14 21:33

加细胞悬液时不要从中间或其他固定点加，可以以螺旋形状转圈加，也可以十字加，轻轻晃动，还有就是在加以前把离心管里的细胞间断吹打均匀，以保证开始和最后的细胞密度一致。自己摸索吧

作者: ero11 时间: 2015-11-14 21:33

最近也在做转染，用24孔板，之前做了2次都不匀，之后就越来越好了。细胞悬液加到板子里后流动，碰壁后受阻力沉到板子底，如果加液体时往板子中央加，这时细胞往周边流动，就倾向与沉到孔的四周，所以我的方法是：
1、消化一定要充分，保证细胞打散成单个
2、有的战友说十字型晃板子，这样晃后细胞很容易聚到中间，导致中间密，周边稀，我不建议这样做
3、加细胞悬液时尽量慢并轻的贴着孔壁，这样细胞慢慢铺散开会相对匀
4、种完板子后静静等2分钟，待细胞沉下去后在镜下观察，如果不满意就轻轻用吸管吹打，注意抽吸一定尽量轻，避免气泡产生
我就是这么做的，现在种板子是越来越匀啦，祝大家好运：）

作者: dreaming 时间: 2015-11-14 21:34

种60mm或者以上的皿可以用十字架的方式上下左右晃动的方法使细胞均匀分布，但是对于六孔板或者更小的，以上方法则不是很管用。
我的方法：
细胞打成悬液时一定要多打几次，然后种入板中，先顺时钟旋转几下，然后用手指掌侧轻轻拍动板的边缘（横的边缘和纵的边缘），这种轻微的震动完全可以使得细胞逐渐分散开来。
这也是我的师兄传授的。希望对您有帮助

作者: cbou876 时间: 2015-11-14 21:34

我同意楼上的，最重要的前提是你要保证制成的细胞悬液是均匀的。这句话包含两层含义：1，消化细胞一定要充分；2，往plate里面接种时一定要注意混匀细胞悬液。
但个人意见还是前者最重要，我似乎没有遇到你所说的情况。回头发一张细胞悬液的涂片给你看看。

作者: qqshepherd 时间: 2015-11-14 21:35

我的体会是 1.种板前尽量混匀后吸取 2.接种时以中等速度、匀速、近孔中央一次加入。
3.接种完毕后，可在超净台内静置10-20分钟，待所有细胞自然沉降后，放入培养箱。

作者: jingling845 时间: 2015-11-14 21:36

接种前，将细胞消化成单个，分孔时，将细胞混匀，分装以后同一方向摇动，摇匀即可！

作者: remonte 时间: 2015-11-14 21:36

我的方法是：
现在24孔板中加入培养基，种细胞悬液时螺旋式加入，种完后盖上盖子，用手掌对着一横边和一纵边轻轻拍打，然后再对着拍打过的横边和纵边的对角轻轻拍打，切忌四个边都拍打，这样细胞很容易聚到中间。接着放到培养箱中不用管它，第二天看一般都比较匀。

作者: yyaxw84 时间: 2015-11-14 21:37

个人觉得好像接种没有那么玄乎吧，我都是随手把细胞悬液注入盘底即可，似乎没有关注过接种是否均匀的问题，下面是一张细胞悬液的计数图片，细胞悬液是纯手工机械打造，没有使用任何消化酶。

图片附件: 28231379.snap.jpg (2015-11-14 21:37, 46.67 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=38744

作者: yapuyapu 时间: 2015-11-14 21:38

方法两个：经验之谈
1、十字法。看你是轰动的幅度等会影响。
幅度不要太大，就是不要太快。而且，可以把板子几乎立起来，用劲抖动，按照十字形顺序进行。
切记不可十字晃动太快，不然本来均匀的都会聚到中间。或者不小心，就是聚到边缘。一般聚在中间居多。
2、现在板中加部分培养基，铺平板底，这点很重要。然后再散在的滴入细胞悬液，最后用十字法轻轻、稍微轰动。
最后，切记，均匀铺板后要慢慢的移动。

作者: sunbent 时间: 2015-11-14 21:39

对于大一点的孔板，用十字的方法操作可以把细胞铺得均匀；
但是对于48孔板、96孔板用十字法，效果好像不是很让人满意的
我每次把细胞分到每孔以后，用手指轻轻的敲板的四侧（动作要轻）就可以了，效果不错……

作者: standbyme 时间: 2015-11-14 21:39

沿着孔壁稍慢加入即可，就铺的很均匀了。

作者: viviwang1987 时间: 2015-11-14 21:39

孔板内的细胞铺板后不均匀主要是由于细胞铺板后还没有沉积的时候，从超净台“走”到孵箱的过程中孔内的液体漩涡造成的。所以孔面积越大，液体越多，越容易形成漩涡，细胞越容易成团。因此，96孔等小孔铺板后千万不能十字晃动，越晃细胞越不均匀，只要走动时慢点就可以解决。6孔，培养皿等打孔板可以等细胞沉积后在挪动或者在孵箱上十字晃动后再挪到里面就可以解决！

作者: tianmei001 时间: 2015-11-14 21:40

最近铺了两张231细胞的24孔板，发现每个孔都是中间有一堆细胞聚集，周围的比较稀疏，这样会影响我后面的实验，请教如何使24孔板能铺得更均匀些？

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铺完之后划8字或者十字吧。铺的时候吹在培养板的壁上，枪头与水平角度小一点。

作者: redbutterfly 时间: 2015-11-14 21:41

我个人的经验是，96孔板只要是铺细胞前将细胞悬液充分混匀加入即可，如何加貌似没有太大影响，加完后我一般直接放培养箱了，没有遇见过不匀的情况。不放心的话可以先静置，细胞沉降后观察一下。
24、12、6孔板同理，但是大孔的容易出现不均匀的情况，我一般是铺完后等待细胞沉降，镜下观察一下，均匀的话则缓缓转运到培养箱；如果不匀，则十字摇起细胞，通过轻拍板子侧面使细胞重新悬起，类似楼上战友的方法。

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