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标题: 【求助】吸光度值A可以是大于1的吗？ [打印本页]

作者: niangao1980 时间: 2015-11-16 15:14 标题: 【求助】吸光度值A可以是大于1的吗？

我最近作了MTT,随毒性药物的作用，吸光度逐渐降低，我很高兴。
本以为行了，可是，在查文献是却发现，很多文献报的各组吸光度值A都是小于1的，而我的除了空白对照是小于1以外（0.05)，其余都是大于1的，在2.7--1.3之间，我的操作没有问题啊，而且重复2遍实验都是这样，波长是570nm。
我的结果怎么样？吸光度是怎么算的？A值从理论上讲，可以大于1么？

作者: 土坷垃 时间: 2015-11-16 15:15

可以大于1的，供参考。
cuturl('http://www.cbio21.com/ky/meibiaoyi/ascent.htm')
回复：请教：酶活性的测定及标准管的设置问题？ - 丁香园论坛
数值在在2.7--1.3之间，可能你的细胞数接种得比较多吧？
太大的话不在线性范围，误差较大。一般线性范围为0.2－0.7的。

作者: niangao1980 时间: 2015-11-16 15:15

那我的结果还可以写文章么？会不会叫人笑话？

作者: standup 时间: 2015-11-16 15:15

是不是细胞量接种多了，重新做一次麻烦吗？

作者: bling 时间: 2015-11-16 15:16

我也有问题要问，我是以每孔10000个细胞接种的，实验结果出来后，吸光度值都在0.02~0.07之间，可是很多文献都每孔4000个细胞接种，吸光度值却都接近1，我重复了n遍，吸光度值从没超过0.1,这是怎么回事?

作者: ladyhuahua 时间: 2015-11-16 15:16

不同种类的细胞表达的琥珀酸脱氢酶是不同的，并且增殖速度是不一样的，你的细胞可能增殖比较慢，实验这几天没有怎么长，所以应该把细胞密度再传高一些，是原代细胞吧？一般来书增殖都很慢的，所以你估计得提高一倍左右的细胞。不能完全按照书本操作的！

作者: bling 时间: 2015-11-16 15:16

我养的是肿瘤细胞，是买的细胞株，我在进行药物干预时根据文献上的方法先用无血清进行同步化，然后加药，配药时仍用无血清培养基，是不是跟细胞在无血清环境中不能增殖有关，96孔板可获细胞数大概是10的5次方，考虑到我的细胞在实验过程中只会凋亡，基本不增殖，我可不可以，以10的5次方个细胞进行接种，因为我已经接种到10000个了，吸光度值还这么低，我若继续以10000个接种，测出的吸光度值这么低有意义吗？能否用这个作为最后的实验结果？

作者: bling 时间: 2015-11-16 15:17

还有有是吸光度测出来是负值这又是怎么回事，请赐教，谢谢！

作者: bling 时间: 2015-11-16 15:18

我养的是肿瘤细胞，是买的细胞株，我在进行药物干预时根据文献上的方法先用无血清进行同步化，然后加药，配药时仍用无血清培养基，是不是跟细胞在无血清环境中不能增殖有关，96孔板可获细胞数大概是10的5次方，考虑到我的细胞在实验过程中只会凋亡，基本不增殖，我可不可以，以10的5次方个细胞进行接种，因为我已经接种到10000个了，吸光度值还这么低，我若继续以10000个接种，测出的吸光度值这么低有意义吗？能否用这个作为最后的实验结果？

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“96孔板可获细胞数大概是10的5次方”，那是针对Hela细胞而言，咱们一般的细胞的大小比Hela细胞大，所以估计减半吧。大概是5X10的四次方左右吧。
考虑你的肿瘤细胞不增殖，你可以接种10000－50000之间的细胞数。另外，不知道你最后做MTT孵育的时候是否用含血清的培养基，理论上孵育时的应该用含有2-8%左右血清的培养液孵育，有利于细胞吞噬MTT并将其转化(有文献专门报道过，具体原理记不清楚了)。
至于你最后得出负值，是不是你的本底孔没有做好，或者不干净？你再查查原因吧。

作者: zzzz 时间: 2015-11-16 15:18

那我在进行药物干预时应该用无血清培养基还是含血清培养基

作者: BUK 时间: 2015-11-16 15:18

与你非药物干涉时的条件要相同呀，要不哪里来的可比性！

作者: BUK 时间: 2015-11-16 15:19

还有，负值只是在空白空出现的吧，不影响的，跟酶标仪本身调零有关！我觉得你可以加大细胞数，而且最好能知道细胞生长的对数生长期！我一个同学做过对数生长期在第六才出现的细胞株！如果在对数生长期外加干预因素，我认为没什么意义！

作者: bling 时间: 2015-11-16 15:19

那如果我的细胞对数生长期是传代后第三天，我是不是应该在第三天才开始进行同步化，我看有的文献上报道都是传代后第二天也没有同步化就直接加药干预，做出来的结果还挺好，不知是怎么做的

作者: zzzz 时间: 2015-11-16 15:19

我看有的文献上报道都是传代后第二天也没有同步化就直接加药干预，做出来的结果还挺好，不知是怎么做的

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确实，很多实验室都是这么做的，结果也很好，也是认可的。
就是用含血清的培养液培养细胞，然后铺板，铺板24h后，直接用药物干预就行了，血清浓度不超过10%，最后直接加MTT就可以了。

作者: zzzz 时间: 2015-11-16 15:20

这样做出的结果会不会有太多漏洞？

作者: bling 时间: 2015-11-16 15:20

好像我们这边实验室都这么做的呀。
不过，如果你能更严格一些当然更好。不过，中间步骤太多了，同样也影响实验结果的。

作者: zzzz 时间: 2015-11-16 15:21

如果可以那我干脆也这么做得了，实验周期还缩短好几天，我这一段时间做的好不顺利，看到有这么多人帮我解决问题，心情好了不少，真的非常感谢大家的帮助！

作者: bling 时间: 2015-11-16 15:21

你不信去看看文献，大部分都是这么做的，同步化太麻烦了。MTT只是一个简单的实验，说明的问题也很有限，有些不值得。别的实验可以认真一点。

作者: zzzz 时间: 2015-11-16 15:21

我再问大家几个问题，测吸光度值所选波长与什么有关，我用570nm，你们用哪个波段的波长？还有一个96孔板，我用它来做时间梯度，在不同时间段终止反应，为了减少污染，我是等所有实验都做完了在一块加DMSO的，这样有影响吗？还有MTT我加了20ul/孔，DMSO加了150ul/孔，这样可以吗？MTT和DMSO的量要怎么计算？

作者: zzzz 时间: 2015-11-16 15:22

“MTT只是一个简单的实验，说明的问题也很有限，有些不值得。别的实验可以认真一点。”
确实如此，我也觉得不值，人家只做一次就出结果，我都做了十多次了，结果还是不尽人意，我真的好想哭，每次都是0.0几！

作者: bling 时间: 2015-11-16 15:22

没关系的，任何事情只要做了就会有收获的，哪怕是失败的事情。
任何失败的事情，只要不把责任推脱给外界因素，而是从自己身上找原因，那么你永远没有失败！

作者: leifengta 时间: 2015-11-16 15:22

“MTT只是一个简单的实验，说明的问题也很有限，有些不值得。别的实验可以认真一点。”
确实如此，我也觉得不值，人家只做一次就出结果，我都做了十多次了，结果还是不尽人意，我真的好想哭，每次都是0.0几！
我不赞成这种做法，我的ＭＴＴ做了两个月！

作者: leifengta 时间: 2015-11-16 15:23

我认为做研究是很严肃的事情，况且从ＭＴＴ里可以得到很多意外的收获，而且ＭＴＴ本身可以说明很多问题，看你怎么分析结果了！

作者: leifengta 时间: 2015-11-16 15:23

还有加入ＤＭＳＯ的量要和最初反应时液体总量相同才有可比性，要不然自己都说服不了自己！如果你加了药或ＭＴＴ后液体总量是２００微升，那么加ＤＭＳＯ的量就是２００微升，这样才可以更好地排除干预因素以外的影响！

作者: bling 时间: 2015-11-16 15:24

QUOTE:

原帖由 leifengta 于 2015-11-16 15:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

还有加入ＤＭＳＯ的量要和最初反应时液体总量相同才有可比性，要不然自己都说服不了自己！如果你加了药或ＭＴＴ后液体总量是２００微升，那么加ＤＭＳＯ的量就是２００微升，这样才可以更好地排除干预因素以外的影响！ ...

兄弟，好像没有哪本书有这么强调的哦！MTT的原理也不是这么认为的。
另外，固然MTT是一个很好的药物初步筛选的实验，但是，它的原理就限制了它能说明的问题的有限性。
为学当然应该严谨，但是，也需要灵活，固然是不依规矩不成方圆，如果一味的因循规矩，只能成方圆，你就做不了其它东东了，比如说狼牙棒、子母鸳鸯钺、判官笔。呵呵，说笑了！ Tongue

作者: bling 时间: 2015-11-16 15:24

都是可以的，不过我个人认为还是应该用570nm。如果有双波长的话，再加上参考波长603nm。

作者: zzzz 时间: 2015-11-16 15:25

今天我又重做了一板，这回我没用空白对照调零，测出的结果吓我一跳，原来我的空白对照都是0.4～0.6，实验组数值也和这个很接近，怪不得每次用空白调零，测出的吸光度值都那么小，甚至为负，这下我开始怀疑我的空白对照孔了，做空白对照时我是这样做的：除了不加细胞其余都和实验组一样，我这样做对吗？为什么会出现这样的结果？MTT孵育4小时吸出后，还需要用PBS或其它什么试剂冲洗一下培养孔吗？我的空白孔每次加入DMSO后也会出现紫色，实验组出现紫色是因为甲瓒结晶溶解的缘故，而空白也出现这种颜色，是什么原因：培养基、药物还是DMSO?

作者: zzzz 时间: 2015-11-16 15:25

我看你的空白孔测出的值是0.05，你是怎么设定空白孔的？如果我的空白也是这个值，那我想我的MTT实验也差不多快成功了

作者: zzzz 时间: 2015-11-16 15:25

根据站友所说：另外，不知道你最后做MTT孵育的时候是否用含血清的培养基，理论上孵育时的应该用含有2-8%左右血清的培养液孵育，有利于细胞吞噬MTT并将其转化。
我特地做了一个对照，一组用含1％血清的培基进行MTT孵育，另一组用10％的，4小时后，高血清组颜色为深紫色，低血清组的为深黄色（比MTT深点）一开始我还很高兴以为找到原因了，没想到加入DMSO后，高血清组的颜色反而没有低血清组深，一测吸光度值还是如此，高血清组的值不如低血清组大，差别还挺大，这种现象不知该如何解释？

作者: bling 时间: 2015-11-16 15:26

QUOTE:

原帖由 zzzz 于 2015-11-16 15:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

根据站友所说：另外，不知道你最后做MTT孵育的时候是否用含血清的培养基，理论上孵育时的应该用含有2-8%左右血清的培养液孵育，有利于细胞吞噬MTT并将其转化。
我特地做了一个对照，一组用含1％血清的培基进行MTT孵育，另一组用10 ...

本底孔怎么能做出紫色来呢？这很奇怪啊，除了你配MTT的问题，我想不出
其它问题了。
MTT母液用PBS配，过滤除菌，贮存于－20度，可以保存至少2周时间(文献说两周)，其实可以更长的时间。
用含血清的培养液配MTT，必须是现配的，即现用现把MTT母液加在培养液中，然后添加到孔里，血清浓度必须低于10%；你用的MTT是现配的吗？

作者: zzzz 时间: 2015-11-16 15:26

我是用0.01M的PBS配MTT的，而且时间一般不超过一周，一般是提前一天配，不过我把它放到－4度了，这样有影响吗？曾经有人告诉我，说培基放久了会有沉淀，也会影响吸光度，设空白孔是不是就是为了排除培基、药物对吸光度的影响，我的空白设置有误吗？可我的空白孔确实是有颜色的，而且每次做都有，我一直以为是培基和药物造成的，不是吗？还有，青衫，你测出的空白孔的值大概是多少？

作者: niangao1980 时间: 2015-11-16 15:27

你的空白孔怎么会有颜色呢？这很奇怪。我做的空白对照孔平均OD=0.05。波长为570nm。

作者: bling 时间: 2015-11-16 15:27

和大灵通的差不多啊！

作者: zzzz 时间: 2015-11-16 15:27

我的空白是除了不加细胞其余都和实验组一样，不知大灵通你是如何设空白的，进行药物干预时，空白孔要不要也加药，最后加MTT和DMSO时，空白孔要不要加？我已经糊涂了，不知怎么找原因了？我的空白孔的吸光度值比实验孔还高！

作者: niangao1980 时间: 2015-11-16 15:28

你可真实在！空白对照孔里面只要最后加DMSO其实就可以。肯定和也加药，再加MTT，然后加 DMSO效果一样。空白对照孔里面加药也是白白浪费，你有的是药么？那还不如分给我点，我正穷着呢。呵呵。当然，正规操作是要除不接种细胞外，和实验孔完全一致了呀。青衫兄，你的意见呢？

作者: zzzz 时间: 2015-11-16 15:28

我今天特地又做了这样一个实验，12个空白孔都不加细胞和药物，然后分成两组，一组只加培基和DMSO,另一组除了培基和DMSO外，在加DMSO前也同样加了MTT孵育，结果两组空白孔吸光度值没有多大区别，而且今天加入DMSO后，所有的空白孔均为无色，吸光度值也一下降到了0.12～0.13之间，比原来的0.4～0.6少了4倍左右，真的很奇怪，难道药物对吸光度值影响这么大吗？那我的实验组的结果还真不知道是真有那么多活细胞还是由于药物残留产生的呢？

作者: zzzz 时间: 2015-11-16 15:29

还有还有，为什么同一台酶标仪，同一份样本，间隔不同时间测出的值也有很大区别，不同波段，实验组的值差别很大而空白孔的值却相差无几，是不是酶标仪有问题呀？

作者: bling 时间: 2015-11-16 15:30

怀疑你们的酶标仪有问题，你可以同其它实验室的酶标仪比较一下。

作者: niangao1980 时间: 2015-11-16 15:30

我做过的MTT空白值都是几乎为0啊，你的空白孔是怎样设的？我是加入同样量的DMSO.问题是不是你的培养板有问题或是空白设置有问题。请问你具体是怎样设的？
用同样方法处理过得板子直接加同等量的DMSO就可以了。

作者: whitesheep 时间: 2015-11-16 15:31

做过很漂亮的MTT结果，随浓度的变化，梯度在肉眼下都很明显。当时的照片没保存下来，只是作预试验的有一张贴给你看吧，上边是培养基没作MTT,（为了节约）下边棕色的是，深浅不一（与药量有关，只是浓度没设计好，梯度美出来丑死了）首先要排除是仪器的原因，我感觉你的方法有问题，看身边有没有前辈做过。

图片附件: 70656447.snap.jpg (2015-11-16 15:31, 33.8 KB) / 该附件被下载次数 19
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=38762

作者: summerxx 时间: 2015-11-16 15:32

各位：
　　ＭＴＴ吸光度，实际上间接反映细胞的脱氢酶活性．细胞脱氢酶将黄色的ＭＴＴ还原为紫色的甲替结晶，最后紫色结晶被溶剂（乙醇＼ＤＭＳＯ等）溶解后成为紫色液体．脱氢酶活性越高，生成的紫色结晶越多，吸光度越大．最终生成的结晶的绝对量，与细胞数量，每个细胞的脱氢酶活性成正比．你种的细胞越多，生成的紫色结晶越多，吸光度自然越大．由于每个人种植的细胞数不同，每种细胞的增殖速度，脱氢酶活性也不一样，因此，不同实验室之间的吸光度值不能相比．
　　
　　此外，最终用于溶解紫色结晶的溶液的体积是多少？同样多的物质，用不同体积的溶液溶解后，浓度自然不一样，吸光度不一样也就很容易理解了，因为吸光度反映相对浓度而不是绝对量．
　　所以，ＭＴＴ结果吸光度过高，可能的原因是：
　　１．种植的细胞浓度过高或细胞增殖过快
　　２．细胞的脱氢酶活性本身就高
　　３．用于溶解紫色结晶的溶液体积过少
　　相反的情况就可能导致吸光度偏低．
　　最后要说明的是，吸光度值无论高还是低均不影响实验结果，因为是实验组和对照组去比较的，而不是看吸光度的绝对值．

作者: zzzz 时间: 2015-11-16 15:32

谢谢各位！我后来用大家教我的方法空白只加DMSO，并且换了一台酶标仪，做出来的结果确实漂亮了不少，空白孔吸光度值真的只有0.05左右，我想再问大家一个问题，设空白的目的到底是干嘛用?如果只在最后一步加入DMSO能说明问题吗？为什么我按司徒镇强的细胞培养书中的方法设空白（除了细胞不加，其余和实验组一样），做出来差了那么多，我认为我设置空白孔的方法应该不会有错。

作者: zzzz 时间: 2015-11-16 15:32

前辈，你做MTT做了多长时间才能得到一个满意的结果呀，我都快郁闷死了，做了这么久还得不到理想的结果，我每个浓度只设7孔，你设了几孔呀？

作者: gogo 时间: 2015-11-16 15:33

你的实验应该是用mtt法测药物对细胞的作用，所以你说的空白孔实际上是对照孔，应该只加细胞，不加药物。
我们现在做的一个实验，药物和mtt有相互作用，使培养液颜色变深，因此加mtt前需要用PBS洗2遍。

作者: idea2011 时间: 2015-11-16 15:33

请问“进行药物干预时先用无血清进行同步化，然后加药，配药时仍用无血清培养基”，是什么意思，不太明白？我都是用完全培养基接种细胞于孔板待贴壁后，再弃去培养液，加用完全培养液配的药，这样对吗？

作者: zzzz 时间: 2015-11-16 15:34

同步化是为了让细胞处于同一周期，血清饥饿只是其中的一种方法，但如果用无血清培基培养细胞，细胞因失去血清中的生长因子和细胞因子的作用将无法增殖，“进行药物干预时先用无血清进行同步化，然后加药，配药时仍用无血清培养基”，这是我从文献上学来的，开始我也是这么做的，可等实验做下来后发现细胞几乎都凋亡了，尤其是到了48h和72h时，细胞所剩无几，而且，青衫还说过，无血清的培基不利于细胞吞蚀MTT,后来我就改成2％的血清做实验了，也没再同步化了，结果还可以，一般培养时可以用10～15％的培基，但进行药物干预时最好采用小于10％的培基，因为血清中的生长因子和细胞因子对药物会产生影响。
经验之谈仅供参考！

作者: summerxx 时间: 2015-11-16 15:34

因为我们科室MTT做的多一些，所以我做的时候，一开始就还可以。开始时孵育4－6h,结果不稳定。后来，我改成2h，结果比以前好一些，易控制，个人感觉和镜下结果比较统一。

作者: summerxx 时间: 2015-11-16 15:34

楼上说得有道理。只加DMSO应该是用来调零的。其余作细胞的应该根据情况把对照设计好，这是很重要。否则试验说服力不够。一般有空白对照（只有细胞），阳性对照（或已有确定作用的药物对照），剩下的对照如果需要还要加。

作者: summerxx 时间: 2015-11-16 15:35

一般我每个浓度设四个复孔，但每个试验只要结果有意义，至少重复作三次。MTT不是难度很大的试验，而且如zhoues所讲它只是测线粒体中酶的活性，说明问题有限，可以的话，考虑再加别的指标。

作者: zzzz 时间: 2015-11-16 15:35

在进行MTT孵育前要用PBS洗板吗？或者需要换培养液吗？

作者: standup 时间: 2015-11-16 15:36

不需要洗板，更换培养液是根据你实验的需要决定的啦！

作者: standup 时间: 2015-11-16 15:36

还有我一直以为空白孔（不加细胞）是用来平衡板子本身的颜色带来的影响，我现在还这样坚持，所以我觉得空白对照还是要有的！

作者: zzzz 时间: 2015-11-16 15:37

一个板就设一个空白孔应该就可以了吧

作者: standup 时间: 2015-11-16 15:37

是一排,不是一个!酶标仪进板的时候是一排进去的!

作者: join 时间: 2015-11-16 15:37

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其实，如果养的是肿瘤细胞的话，96孔板内细胞浓度可以提高的1000000，毕竟做试验过程中，细胞属于调亡过程，到72小时时测得值易过小。DMSO加100ul/孔就行了吧。

作者: idea2011 时间: 2015-11-16 15:38

呵呵，细胞我的不懂，俺是搞分析的，也来凑凑热闹，我们测吸光度，是根据Beer－Lambert定律，A＝－lgT/T0＝ECl，T/T0叫做透光率，它的负对数就是我们平时所说的吸光度，也叫吸收度，光密度等等。其中E为吸光系数，l为液池厚度。当透光率为0时，也就是说光不能透过液池，这时吸光度最大，为1。但我们实验时会经常出现吸光度大于1的时候，为什么？原因是在于你的样品溶液的浓度太高了，理论上应用Beer定律是有两个前提条件的，一个是单色光（这个和仪器有关），另外一个就是稀溶液（<0.01mol/L），如果你的溶液浓度太大，这是溶液的E值也发生变化，E测＝E真[n/(n+2)^2],n为溶液的折射率，所以会出现A大于1的情况。至于A出现负值，那可能是你把样品池和参比池放反了的原因吧？^_^。

作者: join 时间: 2015-11-16 15:38

其实没必要这么费劲，吸光度其实就是呈色的量化，吸光度越大，颜色越深，先看一下颜色，是否有必要再去比色，不然就是在浪费时间，另外，主要去空白

作者: feixi 时间: 2015-11-16 15:38

各位前辈我最近也在作MTT,我作了三个多星期将近十块板,可是一无所获,郁闷至极.我的OD值总是很低0.3左右,组间变异也很大.我一直在调整细胞密度,我觉得细胞真的是长得很好,密度也够的,不知什么原因,直到最近我在加DMSO之前在显微镜下看了看,吸出培养基然后用PBS洗过后又在显微镜下看看,结果发现细胞差不多都快完了,我又看了下废液杯,里面好多结晶样的细胞,我这才知道原因何在,但是我的是贴壁细胞怎么会出现这种情况呢,怎么避免呢?请求各位前辈不吝赐教!谢谢!

作者: gmjghh 时间: 2015-11-16 15:39

QUOTE:

原帖由 feixi 于 2015-11-16 15:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

各位前辈我最近也在作MTT,我作了三个多星期将近十块板,可是一无所获,郁闷至极.我的OD值总是很低0.3左右,组间变异也很大.我一直在调整细胞密度,我觉得细胞真的是长得很好,密度也够的,不知什么原因,直到最近我在加DMS ...

加DMSO之前不要用PBS洗的，否则很多细胞会掉下来的。尤其是加了对细胞有毒性的药物，细胞状态差的时候，加完MTT很容易被PBS洗下来的。

作者: niangao1980 时间: 2015-11-16 15:39

有哪本书里面说过加DMSO之前要用PBS洗的么？那简直是错误之极呀！那结晶可是很重要的啊，洗了就完蛋了。怪不得你的OD那么低，我最近MTT技术长了好多，基本可以把每次的 OD控制在0.1--0.7范围内。我觉得关键在于接种的细胞数。

作者: 逗号是句号 时间: 2015-11-16 15:39

我认为加DMSO之前吸弃培养液总会有点残留,因此MTT设空白时应当这样设:孔B2(培养液+MTT),加DMSO之前与其它孔相同操作吸弃培养液、加DMSO，以孔B2为空白孔进行检测。不知是否合适。

作者: 嗅嗅 时间: 2015-11-16 15:40

我认为加DMSO之前吸弃培养液总会有点残留,因此MTT设空白时应当这样设:孔B2(培养液+MTT),加DMSO之前与其它孔相同操作吸弃培养液、加DMSO，以孔B2为空白孔进行检测。不知是否合适。

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