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标题: 【求助】质粒已经测序确认开放阅读框内序列没问题 [打印本页]

作者: 妮子@ 时间: 2015-11-24 13:34 标题: 【求助】质粒已经测序确认开放阅读框内序列没问题

这次做原核表达一波三折，这块到最后了，又出问题了。本人用的pET-30载体，BL21菌株，IPTG诱导过后能确定诱导成功了，可是目的蛋白要比预测的小4kD左右（目的条带约55kD），用于表达的质粒已经测序确认开放阅读框内序列没问题……求解，不甚感激！

作者: PP熊 时间: 2015-11-24 13:35 标题: 【回复】

目的蛋白要比预测的小4kD左右（目的条带约55kD）如果SDS-PAGE结果的话也不能说明真的小，SDS-PAGE出来的只是表观分子量，不是真实分子量。如果不符，可以利用质谱、凝胶排阻等确认。

作者: dadaai 时间: 2015-11-24 13:35 标题: 【回复】

这个质谱是不是跟分析化合物质谱差不多啊？凝胶排阻需要哪些东西啊？我们这条件有限，以前师兄师姐都不怎么做分子，所以对这方面了解较少……

作者: p1900 时间: 2015-11-24 13:36 标题: 【回复】

有点不一样，是飞行质谱。
质谱和凝胶排阻都要蛋白纯化后做，凝胶排阻就是凝胶过滤，需要一些已知分子量的蛋白做为标准。

作者: mimima 时间: 2015-11-24 13:36 标题: 【回复】

楼主的那个预测蛋白分子量是怎么预测啊

作者: malong 时间: 2015-11-24 13:37 标题: 【回复】

这位仁兄，你看电泳跑出的结果跟网上预测结果相差4kD~5kD,这属于正常范围吗？？？

作者: xgy412 时间: 2015-11-24 13:37 标题: 【回复】

正常，但最好别的方法验证下。

作者: 兔子 时间: 2015-11-24 13:38 标题: 【回复】

正常，但最好别的方法验证下。

作者: 886爱 时间: 2015-11-24 13:38 标题: 【回复】

诱导表达后马上跑电泳。

作者: 大花猫bb 时间: 2015-11-24 13:39 标题: 【回复】

Are you sure ?诱导表达做完天都黑了，在跑电泳我就要在实验室过夜了，请问诱导表达后马上跑电泳有什么理由吗?谢谢~

作者: 女儿情 时间: 2015-11-24 13:39 标题: 【回复】

兄台，你看我这个分析的对不对，我的上样缓冲液里没有加β-巯基乙醇，但是目的蛋白氨基酸序列里含有半胱氨酸，是不是会形成二硫键使目的蛋白没有完全打开，最终导致跑出来的条带偏小？？？

作者: 哈密瓜 时间: 2015-11-24 13:40 标题: 【回复】

如果是分子间形成二硫键，形成二聚体或多聚体，分子量会偏大；如果是分子内形成二硫键，分子量不变。

作者: malong 时间: 2015-11-24 13:40 标题: 【回复】

学习了，不过分子形状对分子量大小也有影响吧，分子内形成二硫键应该体积变小，是不是分子量要相对小些？

作者: hcy517 时间: 2015-11-24 13:41 标题: 【回复】

你好，正在做原核表达，想请问一下表达载体应该怎么选择尼？后期是要用纯化目的蛋白做抗体的，pET-22，pET-28，pET-30，我应该怎么选择尼？

作者: danzi 时间: 2015-11-24 13:41 标题: 【回复】

最近做表达，也出现了这个问题。蛋白一部分上清表达，一部分包涵体，上清为20KD，包涵体尿素溶解后只有14.用的PET28A载体，测序没有问题，实在不知道什么原因了

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