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标题: 【求助】我做的同一条带的二次电泳结果。 [打印本页]

作者: 兔子 时间: 2015-11-28 11:20 标题: 【求助】我做的同一条带的二次电泳结果。

我的样品加不含巯基乙醇的buffer处理，不煮，直接上百分之九的SDS PAGE胶，
考染，目的条带大约180kd。
然后我切下目的条带，塞到另一块胶的上样孔，条带依然水平，同时做两个。一个加含巯基乙醇的loading buffer，另一个加不含巯基乙醇的，但是含SDS的loading buffer，放置20min，然后正常电压电泳，银染。
第二次电泳后，180ka的带消失，出现四条带，除了最大的90kd的那条带，剩下的三条在我重复实验中都有。样品最开始要跑出切下的胶条，marker不用，这个误差不大，我同时切了前一次marker的90kd的带，也做了二次电泳，迁移率相差不大。
有两个问题想请教：
1：180kd的蛋白，跑出来的这三四条不同大小的带，是不是能表明它是异源多聚体？
2：第一次电泳的上样buffer是不加巯基乙醇，跑出是180kd，为什么第二次胶条也是同样的buffer处理，却跑出小分子量蛋白条带？

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作者: 冰激凌 时间: 2015-11-28 11:20 标题: 【回复】

我纯化的天然蛋白，疏水，离子，分子筛柱子以后，仍然有几个杂蛋白。
我把含有杂蛋白的组分先非还原处理，电泳，然后洗脱复性，底物检测能知道那条带是我要的蛋白。
然后把我要的蛋白条带切下，还原处理，是想看它的亚基构成，然后做N端测序，或者质谱

作者: xiaoxiaojinglin 时间: 2015-11-28 11:20 标题: 【回复】

海上的1900,你好。我原来在纯化我们的蛋白也遇到过你的问题。不过我们现在把疏水的样品先用低浓度的硫酸铵沉淀离心过滤后再上样就几乎看不到杂带了，我的经验与你分享希望对你有有帮助

作者: malong 时间: 2015-11-28 11:21 标题: 【回复】

感觉你这个已经有些像BN page的雏形了，至少原理是一致的。

180kd的条带感觉像是一个蛋白复合物，你在进行第二向电泳的时候，由于加入巯基乙醇与否，并不影响蛋白的分离，表明180kd的蛋白不是通过二硫键维系的多亚基蛋白，而仅仅是一个通过非共价键维系的蛋白复合物。
第二向电泳跑出多组分是不是由于你（在裂解液或page胶）加入了SDS的缘故？

作者: PP熊 时间: 2015-11-28 11:21 标题: 【回复】

我液氮研磨的初蛋白，试过硫酸铵分级沉淀，但是各个浓度的沉淀都有目的蛋白析出。
所以后来真个过程都放弃硫酸铵沉淀。纯化过程中没有试过硫酸铵沉淀，以后可以摸索下条件。
请问你当初是怎么想到要在疏水后再沉淀？还有沉淀的是杂蛋白吗？沉淀后再上样，上的是什么柱子，还是直接跑胶？

作者: zouyou 时间: 2015-11-28 11:21 标题: 【回复】

我也觉得可能是蛋白复合物。
我的第一次和第二次都有在loading buffer和page胶中加SDS，为什么第一次是189kd，第二次就分出了多组分，这个是我一直弄不明白的

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