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标题: 【求助】目的基因和内参基因的Ct值差太多 [打印本页]

作者: yapuyapu 时间: 2015-12-1 09:50 标题: 【求助】目的基因和内参基因的Ct值差太多

我在进行real time PCR相对定量时，使用的是SYBR Green染料法。不管怎么稀释模板，内参基因和目的基因的Ct值总是无法同样处在有效范围内，比方说内参基因的Ct值在15~30之间，而目的基因的Ct值过大（大于35），或者过小（小于15），这种情况该怎么办？

作者: moonlight 时间: 2015-12-1 09:50

每次扩出来的ct值肯定是有出入的，所以要用内参去normalize目的基因，不管你怎么稀释，关键是内参和目的基因的浓度要一致，扩出来后用公式去normalize,你用的什么机器，我们用的R&D公司的IQ5可以直接在程序中分析结果。
“内参基因和目的基因的Ct值总是无法同样处在有效范围内”，楼主指的有效范围是什么？调整好程序后扩出来是什么就按什么算啊。

作者: yapuyapu 时间: 2015-12-1 09:50

就是说内参基因在18个循环就起峰了，而目的基因要在34个循环后才起峰，这样怎么处理

作者: Darcy 时间: 2015-12-1 10:30

可以考虑反转录时候加大目的基因RNA量，比如说你20ul本来用2ug，现在用4ug试试。

作者: junjie05 时间: 2015-12-1 10:31

可以更换内参基因试一下一般内参基因有好几种选择另外的试一下看看。

作者: redbutterfly 时间: 2015-12-1 10:31

同意楼上。
换个内参基因试一下吧，再就是换个反转效率高的反转录酶，不过理论上这样是无法减小两个基因的Ct值差的。

作者: ALALA 时间: 2015-12-1 10:31

看到高手们的指点，受益匪浅。我还有个问题，我用RT-PCR扩出来的内参的Ct值要大于目的基因，反应的体系是一样的，请问可能的问题是什么？不胜感激！

作者: redbutterfly 时间: 2015-12-1 10:32

鄙人也是死ct值在35 不知道该怎么办

作者: shenkunjie 时间: 2015-12-1 10:32

我做的实验结果目的基因CT值比内参CT值小是正常现象吗？？？求解谢谢

作者: junjie05 时间: 2015-12-1 10:33

QUOTE:

原帖由 shenkunjie 于 2015-12-1 10:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我做的实验结果目的基因CT值比内参CT值小是正常现象吗？？？求解谢谢

你知道“实验结果目的基因CT值比内参CT值小是正常现象吗？”了没有啊？

作者: shenkunjie 时间: 2015-12-1 10:33

没有后来没做这个了。。。

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