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标题: 【讨论帖】PCR问题 [打印本页]

作者: 园丁## 时间: 2015-12-1 10:56 标题: 【讨论帖】PCR问题

有问题尽管问！

作者: Darcy 时间: 2015-12-1 10:57

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基因拼接：启动子（2.8kb）与目的基因（950bp）通过基因拼接法连接，中央重叠区为46bp，但是每次连接扩增总是有很强的目的基因片断条带，连接产物产率极低甚至没有，曾采用先将启动子与目的基因单独反应5个循环，后加入两头因为进行30次循环的方法。但效果依然不明显，并发现用宝生物LA酶扩增的效果极差，用宝生物高保真酶Pyrobest扩增效果相对较好，但目的片断产量很少，无法回收，请老兄不惜赐教！！

作者: 园丁## 时间: 2015-12-1 10:57

已经有目的片断产量很少时，可以用PCR产物作为模板，条件严格一些再进行一次扩增，估计能够得到足够的量。

作者: zhenxin 时间: 2015-12-1 10:57

关于引物
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=350428&sty=1&tpg=6&age=0')
还想请问为了验证，我用promega 的反转录试剂盒合成cDNA第一链，用Takara的Ex Taq酶作pcr,反应条件设为94--5min 94度45s 55度30s 72度30s X30 cycle 72度5min, 合适吗？
另外热启动的酶（用抗体封闭）应该怎样用呢？是先94度5min后再加入酶进入循环，还是一开始就可以加入？我以前用普通的Taq酶都是先94度10min 后迅速置冰上再加入酶，放在pcr上直接开始循环，用热启动的酶是不是就不用这样了？
谢谢！

作者: SO2 时间: 2015-12-1 11:00

1.本人细胞数量有限，所以在用trizol提取细胞总RNA时，肉眼无法观察到RNA沉淀，请问是否还有必要继续测定RNA的含量。
2.PCR引物设计时，假如两引物的GC含量相差较大，是否可以使正反引物的碱基数不同而使Tm值接近的方法设计引物。

作者: greenbee 时间: 2015-12-1 11:00

请问TaqMan探针有没有保质期，最长能够保存多久（稀释后）？

作者: 园丁## 时间: 2015-12-1 11:00

你的引物可以使用。做荧光定量RT-PCR，用两步法就可以了，推荐的反应温度94--5min 94度15s 60度60s X35--40 cycle 。
用热启动的酶，一开始就可以加入，并与10XBUFFER，Mg++,引物、探针等混合，分装后加入模板，直接进行PCR循环。

作者: 园丁## 时间: 2015-12-1 11:01

1.本人细胞数量有限，所以在用trizol提取细胞总RNA时，肉眼无法观察到RNA沉淀，请问是否还有必要继续测定RNA的含量。
2.PCR引物设计时，假如两引物的GC含量相差较大，是否可以使正反引物的碱基数不同而使Tm值接近的方法设计引物。

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答：1。没有必要。
2。可以。并且经常这么用。

作者: 园丁## 时间: 2015-12-1 11:01

请问TaqMan探针有没有保质期，最长能够保存多久（稀释后）？

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答：-20度保存，10-12个月没有问题。更长时间就不知道了。

作者: summerxx 时间: 2015-12-1 11:02

请问如何选择TAQMAN探针？

作者: yapuyapu 时间: 2015-12-1 11:02

simon_ws
Posts: 14
Score: 1
2003-09-13 18:46
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请教Mg2+对Ex taq酶的活性有什么样的影响，一般什么情况下加入？

作者: whitesheep 时间: 2015-12-1 11:02

请问taq酶的活性在常温下能保持活性多久？在线等！thanks

作者: hyuu 时间: 2015-12-1 11:04

我的PCR产物电泳时条带很弱，今天我将模板加量、引物及酶加倍，感觉好一些，但仍不理想，我的退火温度已经降到50度了，但是没有非特异带，酶的质量应该没问题，因为别的产物已经扩出来了。不知还有什么办法。

作者: 园丁## 时间: 2015-12-1 11:05

请问如何选择TAQMAN探针？

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答：可以到ABI公司的网页看一看，有参考文献。
cuturl('http://www.appliedbiosystems.com.cn/chinese/pe_h2-add1.html')
另外，ABI公司有相关的引物及TaqMan探针设计软件。很好用的。

作者: 园丁## 时间: 2015-12-1 11:05

Mg++对taq酶的活性是必须的，合适的Mg++使taq酶的活性发挥到最佳。故在PCR反应时应调节Mg++（因dNTP 引物等可以结合Mg++）。
至于taq酶的活性在常温下能保持活性多久，没有定论。不同厂家不同批次的酶差异较大。一般应尽量使其处于低温。一般液态的taq酶，不易保存，在常温下，放几个小时应该问题不大。固相化的热启动taq酶（如华美公司4度PCR试剂盒内的酶管），常温下放置一个月应该问题不大。

作者: 园丁## 时间: 2015-12-1 11:05

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你的问题：不好回答。不过建议采用以下策略试一试：
1。在降退火温度，可以低到45度
2。增加Mg++的浓度
3。将延伸时间加长

作者: duchy 时间: 2015-12-1 11:06

Ex Taq酶是一种高保真的 Taq酶 ,但是一些PCR返应试剂盒中有的含有Mgcl2有的没有Mgcl2,如下面网站所提供的.
cuturl('http://www.takara.com.cn/asp/product/zh/takaraextaqtm.htm')
专业性较强,理解不透.并且在它所给的几种血样处理中,并没有在PCR反应体系中加入Mgcl2.

作者: eor 时间: 2015-12-1 11:06

我使用两对引物在同一体系中扩增两个目标产物,照说应该是非竞争性PCR,可是在两种目标产物浓度一样的时候由于扩增效率的不同两者的CT值相差始终存在>1的情况,请问各位有什么方法可以使两个目标产物的CT值尽量接近呢?
还有就是PCR的重复性问题,同一标本不同锅的测试,结果却相差很大,如何建立一个标准体系来平衡批间误差,我想合成我的目标产物作标准曲线来解决不知道可不可行,希望你们能给我更好的办法!谢谢!!

作者: eor 时间: 2015-12-1 11:07

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有谁能帮我解决相对定量时内参和目标产物的扩增效率问题？
我用的反应体系为50ul：
１０＊PCR buffer 1 ＊(终浓度）
　　　　　　　　　　２mmol/l　dNTP 0.2mmol/l每种
TaQnase 5U/IU 1U/50ul
25mmol/l Mgcl2 2.5mmol/l
intel reference Primer 1F 1umol/l
1R 1umol/l
MGB probe 0.25umol/l
target Primer 1F 1umol/l
1R 1umol/l
MGB probe 0.25umol/l
Template 0.05ng--0.005ng
循环条件:94 5min 1cycle -------- 95 30sec 60 30sec 45cycle
在内参和目标基因初浓度一样的情况下,如何避免竞争抑制使两个基因的扩增效率一致且相对比值接近1呢?

作者: eor 时间: 2015-12-1 11:07

Ex Taq酶是一种高保真的 Taq酶 ,但是一些PCR返应试剂盒中有的含有Mgcl2有的没有Mgcl2,如下面网站所提供的.
cuturl('http://www.takara.com.cn/asp/product/zh/takaraextaqtm.htm')
专业性较强,理解不透.并且在它所给的几种血样处理中,并没有在PCR反应体系中加入Mgcl2.

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网站所提供的内容我看了。加入Mgcl2是肯定的。如10XBUFFER含有镁离子就不需要再加了。

作者: eor 时间: 2015-12-1 11:07

我使用两对引物在同一体系中扩增两个目标产物,照说应该是非竞争性PCR,可是在两种目标产物浓度一样的时候由于扩增效率的不同两者的CT值相差始终存在>1的情况,请问各位有什么方法可以使两个目标产物的CT值尽量接近呢?
还有就是PCR的重复性问题,同一标本不同锅的测试,结果却相差很大,如何建立一个标准体系来平衡批间误差,我想合成我的目标产物作标准曲线来解决不知道可不可行,希望你们能给我更好的办法!谢谢!!

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1，可以调整引物与探针之间的比例，使其接近于1
2，合成目标产物作标准曲线是可行的。

作者: summerxx 时间: 2015-12-1 11:08

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园丁## wrote:
可以调整引物与探针之间的比例，使其接近于1
我的目标产物和内对照基因在相同浓度的情况下，要如何调整两对引物和探针的比例呢，我的反应体系如下：
反应体系为50ul：
１０＊PCR buffer 　　　　　　　　1＊(终浓度）
　　２mmol/l　dNTP 　　　　　　0.2mmol/l每种
　　TaQnase　 5U/IU 　　　　　　1U/50ul
　　25mmol/l　　　　　　　　　 Mgcl2 2.5mmol/l
intel reference Primer 1F 1umol/l　　1R 1umol/l
intel　refenrence　MGB probe 　　　0.25umol/l
target Primer 1F 1umol/l　　　　　1R 1umol/l
MGB probe 0.25umol/l
Template １ng--0.005ng
循环条件:94 5min 1cycle -------- 95 30sec 60 30sec 45cycle
你能给我一个比较具体的调节探针和引物的比例的protocol
使目标基因和内对照基因的在初始浓度相等的情况下比例为１吗？
谢谢你给我的帮助！！

作者: dotaaa 时间: 2015-12-1 11:08

太好了！我有问题！
我想检测细胞里面TGF teba 1,2,3的表达情况！
已经在genbank里面查到三者的mRNA序列，想设计引物做RT-pcr半定量检测。
设计一个基因的引物除了要考虑这个基因的序列本身，难道还要考虑超家族的其他成员吗，需要避开保守区吗？？？
我在网上查了一下，发现有的文献上提供的引物序列，有明显的dimer,crose dimer ,hairpin,false priming……这样的引物，能扩出来目的序列吗？

作者: 园丁## 时间: 2015-12-1 11:08

实验是靠自己做的，别人只能给你提一些建议，我这里没有protocol。至于引物与探针之间的比例，可以1：1，1：2，1：3的多设计几组进行调节

作者: 园丁## 时间: 2015-12-1 11:09

太好了！我有问题！
我想检测细胞里面TGF teba 1,2,3的表达情况！
已经在genbank里面查到三者的mRNA序列，想设计引物做RT-pcr半定量检测。
设计一个基因的引物除了要考虑这个基因的序列本身，难道还要考虑超家族的其他成员吗，需要避开保守区吗？？？
我在网上查了一下，发现有的文献上提供的引物序列，有明显的dimer,crose dimer ,hairpin,false priming……这样的引物，能扩出来目的序列吗？
......

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你的引物设计在哪个部位，自己可以查资料。但设计引物时，不要太相信软件了。经常是有明显的dimer,crose dimer ,hairpin,false priming……这样的引物，却能扩出来目的序列来。

作者: 园丁## 时间: 2015-12-1 11:09

应该是调整引物（目的基因：内标）和探针（目的基因：内标）的比例。

作者: wanglaoshi 时间: 2015-12-1 11:09

版主，这是我的问题
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=379619&sty=1&tpg=1&age=0')

作者: ending 时间: 2015-12-1 11:12

我不知道怎么回事，PCR的结果总是很奇怪：
可以P出目的片断，但是很弱，然而上样BUFFER前面的那条带倒是很亮（我估计是引物二聚体），每次都有这样的结果，高手能告诉我原因在哪里吗？
我用的引物是五月份合成的，我配好后，只做过一次PCR，当时目的条带很亮，然后冻存在－20度，直到这个月初才拿出来继续做，是不是引物有问题呢？因为我的模板是才抽的质粒，酶切是有目的基因的。

作者: 不请自来 时间: 2015-12-1 11:12

本人细胞数量有限，达到10的7次方数量的细胞很困难，请问用trizol提取细胞总RNA做PCR需要多少最少数量的细胞。
此外细胞数量少的话有什么方法可以提高trizol的提取效率？是否有说法在加异丙醇后在-20度保存2小时后再离心可以获得更多的RNA？

作者: jude 时间: 2015-12-1 11:13

用外文文献中找到的引物和genebank对，若实在找不到，在genebank中找到所要扩增的序列，自己设计引物。

作者: jude 时间: 2015-12-1 11:13

重新配置PCR反应混合物。引物冻存在－20度，几月一般没有问题。
建议在重新配置PCR反应混合物时，降低镁离子试一试。或者换用热启动DNA聚合酶。

作者: jude 时间: 2015-12-1 11:13

1。请问用trizol提取细胞总RNA做PCR需要多少最少数量的细胞。
答：没有定数，这要看你要扩增的mRNA的丰度，一般100000就够了。
2。有什么方法可以提高trizol的提取效率？
答：不知道。
3。是否有说法在加异丙醇后在-20度保存2小时后再离心可以获得更多的RNA？
答：对。最好能过夜。

作者: xuuuu 时间: 2015-12-1 11:14

请帮我看一下，谢谢！！
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=381528&sty=1&tpg=1&age=0')

作者: dotaaa 时间: 2015-12-1 11:14

PCR的初学者,请问如何查出外显子,而且如何知道外显子的顺序?

作者: 33号 时间: 2015-12-1 11:15

你好，我象问你通过降落PCR的复性温度连续降低，如何确定最佳复性温度，哪一个是最佳的

作者: jude 时间: 2015-12-1 11:15

1。请问用trizol提取细胞总RNA做PCR需要多少最少数量的细胞。
答：没有定数，这要看你要扩增的mRNA的丰度，一般100000就够了。

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10的5次方个细胞用trizol提取总RNA是否是看不到的，按你上面的说法如果提取的RNA看不到就没有继续做后面的逆转录了，那是否说10的5次方个细胞在实际操作中不太可行？
另外还有一个问题，一般我提取的RNA OD260/OD280在1.6~1.8之间，是否纯度不太好？请问在提取时有什么方法可以提高RNA的纯度吗？纯度低对于后续的操作有什么影响吗？如果OD260/OD280的值在1.6，是否在逆转录时可以适当增加总RNA的量？

作者: qhyu 时间: 2015-12-1 11:15

RNA浓度低，肉眼肯定看不见沉淀的,（我提病毒的，才20ug/ML),你可以测OD值及浓度，然后决定RT酶的用量。
“PCR引物设计时，假如两引物的GC含量相差较大，是否可以使正反引物的碱基数不同而使Tm值接近的方法设计引物。 ”
当然可以！

作者: jude 时间: 2015-12-1 11:16

按楼上的说法是否是指，加入异丙醇后，离心随后去除上清，即使没有见到沉淀也同样去除上清？然后再用75%酒精洗净？酒精洗的时候尽量不要把看不到的沉淀倒掉？
是否也就是说提取RNA最重要的是保证RNA的纯度，即使OD260/OD280尽可能保证在2.0？而对于提取的用做逆转录的RNA量并不是要求很多？
假使OD260/OD280的比值相对较低些达到1.6是否在逆转录时可以相应增加加入的RNA总量？

作者: PINK 时间: 2015-12-1 11:16

请教关于长片段基因的PCR问题
请教；我用的是ROCHE 公司的 Expand Long Template PCR System 扩增我的目的基因，但没有目的带。目的基因为2456个bp。反应条件设定为：94度2分一个循环；94度10S，60度30S，68度2分，35循环。68度7分一个循环。请教各位，谢谢。还有如果用普通的Taq酶如何可以保证有低错配率？？

作者: 园丁## 时间: 2015-12-1 11:17

因最近几天，单位线路问题不能上网，故不能及时回答各位战友的问题，本人深表歉意！
人今天本人要出差，以上各位的问题，已不能回答。等本人十月一日回来后再作回答。再次表示歉意！

作者: 莲花白 时间: 2015-12-1 11:17

MBI的PCR反应体系提供了两种10xpcr buffer: 一种是无mg2+,一种是内有硫酸铵的，
以前有帖子：铵离子会影响PCR的反映，
为何MBI还要提供此种buffer?
请问，那种PCR需要铵离子，或者说，铵离子的作用是什么？
恳请指点，谢谢！

作者: okhaha 时间: 2015-12-1 11:18

很对！100ng即可做逆转录（用invitrogen的superscritII据说50ng即可）

作者: seagate 时间: 2015-12-1 11:18

让我奇怪的是，现在我提取mRNA的纯度下降了，与我采用的培养基有关系吗？我以前用的是无酚红的1640培养基，而现在用的是高糖的DMEM培养基，请指教！多谢了！

作者: 00无名指00 时间: 2015-12-1 11:18

我想用RT－PCR钓一个基因，mRNA约3kb，其间还有一个颈环结构，应该如何对付？

作者: caihong 时间: 2015-12-1 11:19

大侠，我最近扩增一个300多个碱基的目的片断，三周前摸条件时还好好的，目的片断条带很亮，退火温度范围也很宽，可现在不是为什么，死活就跑不出来了，即使用原来的模板也跑不出来了，请帮忙分析一下，有可能是哪里出了问题，如何解决，我已经快疯了！我是25ul的体系，cDNA用的是2ul.

作者: owanaka 时间: 2015-12-1 11:19

本人细胞数量有限，达到10的7次方数量的细胞很困难，请问用trizol提取细胞总RNA做PCR需要多少最少数量的细胞。
此外细胞数量少的话有什么方法可以提高trizol的提取效率？是否有说法在加异丙醇后在-20度保存2小时后再离心可以获得更多的RNA？

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量很少的样品中加入糖原以提高RNA的产率。糖原（低于4mg/ml）的存在，不影响cDNA第一链的合成，也不会影响PCR。细胞量少时（102-104个细胞）加800ul+Trizol（Gibco)，混匀后加入5-10ug的去RNA酶的糖原以得到水相。

作者: kuaizige 时间: 2015-12-1 11:20

求救，我现在有一个片断不能扩增出来，引物分别为44和32bp,退火温度分别为
77.8和64.7，片断长度为852bp，引物浓度为20pM。不过引物选的特异性结合序列只有20bp，请问各位我该怎么设定我的反应条件。用的试剂均为Takara产品。

作者: 04906 时间: 2015-12-1 11:21

1.本人细胞数量有限，所以在用trizol提取细胞总RNA时，肉眼无法观察到RNA沉淀，请问是否还有必要继续测定RNA的含量。
2.PCR引物设计时，假如两引物的GC含量相差较大，是否可以使正反引物的碱基数不同而使Tm值接近的方法设计引物。

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这个问题我会：我来顶。
1 细胞有限时，RNA量肯定非常少，不过我认为还是要定量的，关键是看260与280的比值，（如果你定量时用的RNA量太多就不用定了，我们这里只要80ul就够了。）可以直接做PCR，但是要带上阳性对照，如B-actin。
2 可以。

作者: 04906 时间: 2015-12-1 11:21

大侠，我最近扩增一个300多个碱基的目的片断，三周前摸条件时还好好的，目的片断条带很亮，退火温度范围也很宽，可现在不是为什么，死活就跑不出来了，即使用原来的模板也跑不出来了，请帮忙分析一下，有可能是哪里出了问题，如何解决，我已经快疯了！我是25ul的体系，cDNA用的是2ul.

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出了问题找原因和很麻烦那。每一步都要有阳性的东东，才能找到真正的原因。一个条件一个条件的换吧

作者: ujne 时间: 2015-12-1 11:22

让我奇怪的是，现在我提取mRNA的纯度下降了，与我采用的培养基有关系吗？我以前用的是无酚红的1640培养基，而现在用的是高糖的DMEM培养基，或者与血清有关吗？请指教！多谢了！

作者: sunbent 时间: 2015-12-1 11:23

HLA的郁闷啊！

作者: ns5fan 时间: 2015-12-1 11:23

我是一个新手，最近请公司帮我设计了3个引物做RT-PCR，请高手帮我看一下，谢谢！
这是3个引物的具体情况：
目的基因：脂蛋白脂酶 lpl引物设计结果来自genebank序列文件: NM_012598.
原序列总长度为 1425
引物总数有 2 对
第 1 对引物
5'->3' 408 CAGGTTCATCAACTGGCTGG 427
3'->5' 888 GAAACTCTTTCCCGAGACGG 907
第 2 对引物
5'->3' 410 GGTTCATCAACTGGCTGGAG 429
3'->5' 890 AACTCTTTCCCGAGACGGAC 909
以下为内参照：
beta-actin引物设计结果来genebank自序列文件: NM_031144
原序列总长度为 1128
引物总数有 2 对
第 1 对引物
5'->3' 655 GTTGCCCTAGACTTCGAGCA 674
3'->5' 885 GTTGTGTCACGACAGACCAC 904
第 2 对引物
5'->3' 718 TATGAGCTGCCTGACGGTCA 737
3'->5' 948 CTAATGACGGGACCGAGGAT 967
3磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH引物设计结果来自序列文件: X02231
原序列总长度为 1002
引物总数有 1 对
第 1 对引物
5'->3' 282 GGAGTCTACTGGCGTCTTCA 301
3'->5' 512 CCGAGTACTGGTGTCAGGTA 531

作者: zhenxin 时间: 2015-12-1 11:23

please:
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=491884&sty=1&tpg=2&age=0')
thanks

作者: feixi 时间: 2015-12-1 11:24

你好，请问有没有分析RT-PCR的凝胶成像的软件？亮度扫描的。

作者: 12xunmei 时间: 2015-12-1 11:25

求教，检测SHP-1、SHP-2的引物是什么，请指教

作者: idea2011 时间: 2015-12-1 11:25

请问PCR最后一步72度若干分钟是必要的吗，就是在循环结束后仍然延伸一段时间。因为我最近用文献的PCR引物和条件就是P不出来，文献所提供的程序没有最后这一步的延伸，而是循环结束后直接结束，请问这有影响吗？

作者: iii_ii 时间: 2015-12-1 11:25

提取人外周血基因组DNA纯度的问题,需提取标本量较大,如何解决?

作者: qhyu 时间: 2015-12-1 11:27

请大家帮忙：我的目的片段是560BP，我用62度退火总扩出一条很亮的带，没有其他任何杂带。我开始以为是目的片段，后用MARK一点，发现是目的条带两倍的大小，怎么会这样，大家帮帮我。我急。

作者: zhenxin 时间: 2015-12-1 11:30

我要扩3768BP的片断，CDNA已经得到，不知道这么大的片断，扩的出来吗。
还有，即使扩出来了，这个片断能装到我的载体中去吗，我的载体是5。6KB大小的。望各位高手指点一二，不胜感激

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