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标题: 【求助】有关扩增效率 [打印本页]

作者: uuooii 时间: 2015-12-4 15:45 标题: 【求助】有关扩增效率

本人新手，弱弱的问一句，用ΔΔct法或pfaffl法做相对定量的荧光定量PCR，在不做标准曲线的情况下，怎么计算扩增效率？是软件在PCR是会自己计算出来吗？我用的是罗氏的lightcycler

作者: 49888 时间: 2015-12-4 15:45

不做标准曲线是不能得出扩增效率的，还是做个标准曲线吧。

作者: uuooii 时间: 2015-12-4 15:45

标准品如何制作呀？我已经从组织中提取了Total RNA出来了，并且经过RT已经合成出cDNA了。现在不知道怎么制备标准品来制作标准曲线、计算扩增效率。因为没有构建质粒的条件，除了构建质粒还有其它方法吗?希望各位帮忙。希望各位帮忙。谢谢！

作者: 49888 时间: 2015-12-4 15:46

你做的是相对定量，可以用直接用的cDNA做标准品。要是做绝对定量的话，才要用质粒做标准品。

作者: uuooii 时间: 2015-12-4 15:46

我还有些具体的没弄清楚，盼继续能予以帮助。具体怎么直接用cDNA做标准品？能否告诉我实验步骤？

作者: uuooii 时间: 2015-12-4 15:47

我有空白组、手术组和药物干预组，应该选哪个组的cDNA来做标准品，谢谢！

作者: vvmmoy 时间: 2015-12-4 15:47

罗氏的lightcycler软件提供相对定量的分析啊，前一段时间刚学会的，还是蛮好用的，就是复杂啊，功能强了的副作用Wink
软件里做不做标准曲线都可以进行相对定量分析，ms也可以调用以前的标准曲线做分析，不过自己没试过，不知道效果怎么样。
不过不做标准曲线就不给扩增效率的了。
我看过单个样品扩增曲线算扩增效率的说法，听下来感觉就是忽悠，影响因素太多了，不具有实际应用价值

作者: redbutterfly 时间: 2015-12-4 15:48

请问罗氏的lightcycler软件在不知道内参基因、目的基因以及目的基因在处理前后的扩增效率的情况下不用做标准曲线也能够进行相对定量分析是运用的什么方法？其原理是什么？因为不知道内参基因与目的基因的扩增效率是否相同以及是多少，就不能用ΔΔct法；不知道处理前后的扩增效率是否相同以及扩增效率的量，就不能确定用pfaffl法。盼回复！

作者: 3.14 时间: 2015-12-4 15:48

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1. roche的软件里相对定量分析中不设置calibrator的话那就是pfaffl法
2. roche软件里相对定量分析里不用标准品（内置或外置曲线）的话就是默认扩增效率等于2，所谓不知道扩增效率其实都是默认扩增效率等于2，就是2的ΔΔct法
3. roche的软件里如果用了内置标准曲线或者调用外部标准曲线那么就是标准曲线法
4. 基本上各种相对定量分析方法ms可以在roche软件的一个相对定量模块里全部实现。不过要解决问题，楼主首先要懂相对定量怎么回事，然后勤问roche的人哦！有些资源不用白不用，不要浪费呀
我上面说的可能比较简单，因为说复杂了可能lz更糊涂，直接问roche去吧。我用的是roche的lightcycler480，不知道楼主用的是roche 哪个机器？
顺便说一下，roche的软件确实复杂晦涩，功能和隐藏选择太多，对于定量PCR的新手简直是无法掌握，如果能够遇到好的老师那确实感觉会比abi的弱智软件强多了，但如果用不起来确实还不如abi的弱智软件好上手。

作者: txwuyan 时间: 2015-12-4 15:48

问一下，空白组、手术组和药物干预组，你最后选哪个组的cDNA来做标准品？

作者: vera+ 时间: 2015-12-4 15:49

本人新手，近期在做绝对定量pcr，可扩增效率一直在40%-50%之间，请问有什么方法可以提高一下扩增效率吗？我这样低的效率还有提高的可能吗？

作者: xuuuu 时间: 2015-12-4 15:49

设计引物时产物长度不要太长，最好在200以内，在普通PCR上先做一个引物浓度梯度和模板浓度、以及退火温度梯度，看哪个浓度扩增好点。也可以用两步法PCR试一试，如果实在不行就只好换一对引物了。

作者: xuuuu 时间: 2015-12-4 15:49

或者做标准曲线时候调一下阈值和基线看看斜率有没有什么变动

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