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标题: 【讨论帖】成熟脂肪细胞、脂肪干细胞交流 [打印本页]

作者: purrr 时间: 2015-12-11 11:22 标题: 【讨论帖】成熟脂肪细胞、脂肪干细胞交流

额最近一直在养脂肪干细胞，整理了些资料，与大家分享下。也希望就这一块，与各路大侠们多交流交流经验！！

作者: purrr 时间: 2015-12-11 11:24

人来源脂肪干细胞的培养
1．脂肪干细胞原代培养
取约500mg脂肪组织（自外科手术患者的皮下获取），再将脂肪组织一次挤压进入准备好的15ml离心管中，每个离心管中的组织不超过5ml。
吸取缓冲液PBS 7ml加入到上述装有组织的离心管中，用吸管吹打10~20次，然后静置1min左右，用吸管将组织下层的液体吸出。如此反复直到所吸出的液体呈透明状，不带有血细胞为止；
向有脂肪组织的试管中加入与组织量相同大约5ml左右的消化液（胰酶0.25%，I型胶原酶0.1%，以1：1比例混合配制而成），将试管密封，放入37°C恒温摇床中，190r/min，震荡消化30min。此时液面分为3层，上层为黄色油状脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含单个核细胞的液体；
吸出离心管中的下层液体过200目滤网到含完全培养基（含10%胎牛血清的高糖DMEM）的新离心管中终止消化，然后将离心管封闭，1500rpm离心10min；
用吸管吸取上清后去掉，加入1ml 培养基，轻轻吹打10~20次制成细胞悬液，将各个离心管中的细胞悬液收集起来，接种待用；
在剩余脂肪中加入新的胰酶和胶原酶，重复以上步骤继续消化，重复2-3次，将收集到的有核细胞按照一定的密度接种到培养瓶中，放入37°C、5% CO2培养箱培养；
第一次换液：大约12-24小时后，观察细胞贴壁即可进行第一次换液，此后每隔3天换液，待细胞生长至融合后进行传代。
2. 脂肪干细胞传代培养
在超净工作台内吸去培养瓶内的旧培养基，加PBS冲洗2-3次，之后加入1-2mL消化液（0.25%胰酶和0.04% EDTA(v/v 1:1)）；
培养箱内进行消化（3-5min），倒置显微镜下观察贴壁细胞形态变化，当贴壁的脂肪干细胞胞质回缩，细胞间隙不断增大，细胞呈近球形同时有少量圆形细胞脱壁时，加入等体积的培养基终止消化；
用吸管反复有序轻轻吹打瓶壁上的细胞（动作要轻柔，注意不要产生气泡），使细胞脱离瓶壁后呈单细胞悬液；
将单细胞悬液移至离心管中，离心，(1000rpm,5min)，弃上清，加入完全培养基，轻吹使之松散，按1:2传代培养；
显微镜下逐日观察传代培养的细胞，待贴壁细胞达到90% 以上融合时，再进行传代，如此反复。
3. 脂肪干细胞的冻存
将传代培养的细胞悬液以1×106cells/ml的比例加入预冷冻存液（含5% DMSO，30%胎牛血清的DMEM），充分混匀后置预冷的冻存管中。将冻存管置于-80°C低温冰箱中过夜后，投入液氮中保存。
4. 脂肪干细胞的复苏
取出液氮中的冻存管，迅速投入37°C水浴中快速晃动，直至冻存液完全溶解，复温在1-2分钟内完成；
用酒精棉球擦洗存有细胞的冻存管以减少污染；
无菌条件下吸出细胞悬液至离心管中，补加4ml培养基后离心(1000r/min, 5min)，弃上清；
收集细胞，用培养基吹打成细胞悬液接种在培养瓶中，于37°C, 5%CO2培养箱中培养。

作者: purrr 时间: 2015-12-11 11:30

成熟脂肪细胞的油红O染色
原理:利用染料易溶于脂质的性质证明组织脂质含量的多少
染料的配制：油红O 0.5g 溶于100ml异丙醇
染色步骤：
1，稀释，染料同蒸馏水按3：2稀释
2，过滤，通过定性滤纸过滤，没有滤纸的话，可以用口罩过滤；
3，固定，吸弃培养液后加入固定液5min.9 `: G( {1 V. E; P/ P4 Q, y- S
4，吸弃固定液，加入染色液15min后水洗一次镜检观察。
5，苏木晶复染
6，水冲洗至变蓝。观察。
注：5,6两步可选择性省去。
注意事项：
1、过滤要有保障，不然染色后观察时杂质很多。8 ^3 U' u4 q6 R2 H2 n8 k3 u
2、要注意配好的油红O工作液要在2个小时内用，不能放置时间过长。" a" e( A3 ^* b
3、苏木精复染可以使细胞形态更清晰，拍出来的照片效果也会更好。苏木素复染时间不能过长- m( L0 I* c8 H/ m' e/ u2 ^
4、染色结果不能长期保存，应尽快观察及照相。
5、油红O染脂滴是很容易的,如果没有染上,那就可能不是脂滴而是空泡。
附件中为此内容word版本，另附染色效果较好的照片
欢迎大家指正！！

作者: xuuuu 时间: 2015-12-11 11:31

不知如何鉴定为脂肪干细胞？

作者: purrr 时间: 2015-12-11 11:31

QUOTE:

原帖由 xuuuu 于 2015-12-11 11:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

不知如何鉴定为脂肪干细胞？

一般有三种方法：
1，细胞形态鉴定。脂肪干细胞培养48小时后大多数贴壁，并开始伸展、分裂，呈梭形，有粗大突起。
2，细胞表面特异标志物鉴定。
3，细胞成脂能力诱导鉴定。

作者: 33号 时间: 2015-12-11 11:32

ADSC没特异性的表面标记物，是否用干细胞的标记物去验证？你做过这方面的验证吗？

作者: bojitu 时间: 2015-12-11 11:32

比较有用，我现在研究骨髓间充质干细胞，不知哪位大侠提供一些这方面的资料。谢谢了！

作者: Darcy 时间: 2015-12-11 11:33

ADSC没特异性的表面标记物，是否用干细胞的标记物去验证？你做过这方面的验证吗？

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我们实验室有做过,具体你可参考我分享的那篇文献！

作者: sunnyB 时间: 2015-12-11 11:33

你好，我最近也在做原代脂肪干细胞的培养，但是发现多角形细胞比较多，中间夹杂着呈梭形的脂肪干细胞（像文献中脂肪干的形态），没有出现那种都是梭形而且呈旋涡状分布的情况，想请教下lz，可能的原因是什么呢？

作者: purrr 时间: 2015-12-11 11:33

QUOTE:

原帖由 sunnyB 于 2015-12-11 11:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你好，我最近也在做原代脂肪干细胞的培养，但是发现多角形细胞比较多，中间夹杂着呈梭形的脂肪干细胞（像文献中脂肪干的形态），没有出现那种都是梭形而且呈旋涡状分布的情况，想请教下lz，可能的原因是什么呢？ ...

据我观察，也不是所有的脂肪干细胞都呈梭形，有些就是多角形。呈漩涡状分布的话，一般是细胞密的时候呈现，此时细胞状态应该也是很好的。

作者: wzqzy 时间: 2015-12-11 11:34

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原帖由 purrr 于 2015-12-11 11:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

据我观察，也不是所有的脂肪干细胞都呈梭形，有些就是多角形。呈漩涡状分布的话，一般是细胞密的时候呈现，此时细胞状态应该也是很好的。

那请问楼主，怎么样调整可以让梭形多些，密集些，状态好些呢
我使用含10%FBS的低糖DMEM作为培养基的，加了P/S，传代的话就是0.25%的胰酶了，可就是多角形细胞特别多，状态不好

作者: purrr 时间: 2015-12-11 11:35

这样培养貌似没什么问题，不知道你细胞具体是怎么提取的？

作者: taoshengyijiu 时间: 2015-12-11 11:36

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原帖由 purrr 于 2015-12-11 11:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
这样培养貌似没什么问题，不知道你细胞具体是怎么提取的？

是取人腹部皮下的脂肪组织，剔除血管和纤维组织（肉眼下），然后漂洗剪碎，用0.125%的终浓度I型胶原酶水浴消化40分钟，其中每10分钟会震动10秒，消化的效果还可以，细胞比较多。然后就全培终止消化，1000g/min离心5分钟，我没有过滤，因为之前过滤感觉细胞很少，然后就重悬接种了。
是因为没有过滤么？

作者: taoshengyijiu 时间: 2015-12-11 11:37

但是脂肪干细胞本身就是混杂的细胞，过滤应该对细胞种类影响不大吧？

作者: summerxx 时间: 2015-12-11 11:37

你好，我也在养脂肪干细胞，是大鼠脂肪提取的。
我们用FACs鉴定了stro－1，CD45,CD90,CD105,CD34。其中stro－1没有检测到，CD105也不理想，请问你做细胞表面因子鉴定用的什么方法？检验了哪些因子？
有在支架上（比如BIO－GIDE）上养脂肪干细胞的吗？
谢谢！

作者: purrr 时间: 2015-12-11 11:44

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原帖由 taoshengyijiu 于 2015-12-11 11:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

但是脂肪干细胞本身就是混杂的细胞，过滤应该对细胞种类影响不大吧？

最好还是过滤下，血细胞等杂细胞太多的话对ASCS也不利，我们的经验是用100目的筛网，过滤后如果离心得到的ASCS感觉还是混有太多血细胞，建议用PBS洗下

作者: purrr 时间: 2015-12-11 11:44

Hey,你好，我也在养脂肪干细胞，是大鼠脂肪提取的。
我们用FACs鉴定了stro－1，CD45,CD90,CD105,CD34。其中stro－1没有检测到，CD105也不理想，请问你做细胞表面因子鉴定用的什么方法？检验了哪些因子？
有在支架上（比如BIO－GIDE）上养脂肪干细胞的吗？
谢谢！
......

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您好，我们用的是流式细胞分析鉴定。实验室检验过CD49，其它的不太清楚。没在支架上养过，不过我们老板在国外留学时做过

作者: duchy 时间: 2015-12-11 11:46

Hey,你好，我也在养脂肪干细胞，是大鼠脂肪提取的。
我们用FACs鉴定了stro－1，CD45,CD90,CD105,CD34。其中stro－1没有检测到，CD105也不理想，请问你做细胞表面因子鉴定用的什么方法？检验了哪些因子？
有在支架上（比如BIO－GIDE）上养脂肪干细胞的吗？
谢谢！
......

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你养的细胞中游多少是脂肪干细胞，CD45的阳性率是多少，九十几啊。另外你对细胞进行诱导分化方面的实验吗

作者: summerxx 时间: 2015-12-11 11:46

请问,不需要传代,怎样提取更纯的脂肪干细胞?

作者: purrr 时间: 2015-12-11 11:47

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原帖由 summerxx 于 2015-12-11 11:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问,不需要传代,怎样提取更纯的脂肪干细胞?

消化离心后可用筛网过滤，PBS洗2-3遍~

作者: duchy 时间: 2015-12-11 11:47

小弟用的是f12的培养基进口胎牛血清 15% 现在细胞长的很快基本2代以后三天就可以传代感觉有点不想脂肪干细胞，求高手指点啊小弟万分感谢

作者: duchy 时间: 2015-12-11 11:47

重新上传下
原代

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=39398

作者: duchy 时间: 2015-12-11 11:48

原代第4天

图片附件: 9000da02gw1dqlkuuumpjj.jpg (2015-12-11 11:48, 295.51 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=39399

作者: duchy 时间: 2015-12-11 11:48

第2代

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作者: duchy 时间: 2015-12-11 11:48

第3代

图片附件: 9000da02gw1dqlkx0gbyjj.jpg (2015-12-11 11:48, 194.79 KB) / 该附件被下载次数 14
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=39401

作者: purrr 时间: 2015-12-11 11:49

QUOTE:

原帖由 duchy 于 2015-12-11 11:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

第3代

应该是的，状态也越来越好了

作者: duchy 时间: 2015-12-11 11:49

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原帖由 purrr 于 2015-12-11 11:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

应该是的，状态也越来越好了

再请教下第二代的那张图细胞有两种形态数量少的是干细胞还是数量多的是干细胞小弟我现在传代还是很不稳定

作者: purrr 时间: 2015-12-11 11:52

细胞形态跟状态也是有关的，状态不好时，细胞形态也会异样

作者: duchy 时间: 2015-12-11 11:53

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原帖由 purrr 于 2015-12-11 11:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

细胞形态跟状态也是有关的，状态不好时，细胞形态也会异样

我觉得我养的里面有很多杂细胞如何纯化呢差速贴壁法？可实际操作时发现很难，时间把握不好啊。。。

作者: duchy 时间: 2015-12-11 11:53

有哪位大侠冻存过脂肪干细胞吗？冻存液怎么配，血清浓度多少好，我查了下血清有些用10%有些用90%，过高浓度会不会使干细胞分化？

作者: zhenxin 时间: 2015-12-11 11:54

养的小鼠脂肪干细胞，请问培养条件跟人脂肪干细胞有什么区别没有？原代培养4天了还是没看见脂肪细胞~~~

作者: biabiade 时间: 2015-12-11 11:54

你好，我最近也在做原代脂肪干细胞的培养，但是发现多角形细胞比较多，中间夹杂着呈梭形的脂肪干细胞（像文献中脂肪干的形态），没有出现那种都是梭形而且呈旋涡状分布的情况，想请教下lz，可能的原因是什么呢？

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多角形细胞是不是有可能是混进了部分上皮细胞？

作者: @木木@ 时间: 2015-12-11 11:55

楼上的图片和我养的差不多，不知道楼主最近养的怎么样了？我的铺板已经10天了还没有自分化为成熟脂肪细胞，请问楼主有诱导吗？

作者: purrr 时间: 2015-12-11 11:55

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原帖由 @木木@ 于 2015-12-11 11:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼上的图片和我养的差不多，不知道楼主最近养的怎么样了？我的铺板已经10天了还没有自分化为成熟脂肪细胞，请问楼主有诱导吗？

自分化本来就很慢的，代数较高时会快些。一般是用成脂诱导，2-3周样子

作者: ero11 时间: 2015-12-11 11:55

duchy，请问中间那些亮的是不是脂滴？原代细胞能自主分化吗

作者: eric930 时间: 2015-12-11 11:56

人脂肪干细胞与大鼠小鼠的培养有区别吧？

作者: mogu 时间: 2015-12-11 11:56

我做的是脂肪干细胞成骨诱导，可是在加诱导液前脂肪干细胞形态变得多角，而且里面有一些亮的似油滴样的物质，请问这是什么状况啊是不是分化成脂肪细胞了。该如何鉴定

作者: duchy 时间: 2015-12-11 11:56

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原帖由 mogu 于 2015-12-11 11:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我做的是脂肪干细胞成骨诱导，可是在加诱导液前脂肪干细胞形态变得多角，而且里面有一些亮的似油滴样的物质，请问这是什么状况啊是不是分化成脂肪细胞了。该如何鉴定 ...

感觉可能是细胞状态不好，最好贴图

作者: 2541 时间: 2015-12-11 11:56

有做脂肪干细胞上清液研究的吗？还有，诱导成脂细胞后期应用的。

作者: sunbent 时间: 2015-12-11 11:57

你好，诱导后的3T3_L1成熟脂肪细胞是贴壁还是悬浮的？油红o是做爬片还是直接滴细胞悬液在玻片上风干？非常感谢！

作者: purrr 时间: 2015-12-11 11:57

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原帖由 sunbent 于 2015-12-11 11:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你好，诱导后的3T3_L1成熟脂肪细胞是贴壁还是悬浮的？油红o是做爬片还是直接滴细胞悬液在玻片上风干？非常感谢！

贴壁的；
直接在皿里固定，然后加入油红O染就行

作者: yizhi 时间: 2015-12-11 11:58

您好，版主，我今天也是做的油红O染色。
储备液:0.05g溶于10ml异丙醇
工作液配置，储备液：工作液=3：2
工作液：现配现用，用前过滤2次
10%甲醛磷酸盐缓冲液配置：1ml甲醛分析纯加入9mlPBS里面
步骤：弃原液
PBS洗3遍
10%甲醛磷酸盐缓冲液固定20min，室温
弃固定液，PBS洗3遍
油红O工作液染色30min室温
弃染色液，三蒸水洗3次
镜下看到：杂质黑点很多，看到脂滴，但是然不上颜色，而且背景有颜色的部分是紫兰色的。请指导。

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