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标题: 【求助】关于检测细胞内ROS的荧光染料DCFH的实验方法问题 [打印本页]

作者: 嗅嗅 时间: 2015-12-12 16:54 标题: 【求助】关于检测细胞内ROS的荧光染料DCFH的实验方法问题

准备用DCFH检测金属配合物诱导的细胞凋亡中ROS的浓度水平变化，看了很多文献中这方面的实验方法，发现都有些差异，有些是在用药物处理细胞前加入DCFH，一般是37度30min，然后PBS洗，再用药物处理；有些是药物处理细胞不同时间后再加入DCFH；有些是药物和DCFH同时处理细胞；这几种方法有什么差别呢？
还有检测时的问题，用荧光分光光度计检测时是否需要将细胞裂解，离心测上清的荧光强度？有些文献中没提到裂解细胞，拿来就直接测了。结果表示一般是荧光强度/mg protein，直接测定上清的蛋白量就可以了吗？
哪位做过相关的实验，希望交流一下经验，多谢了！

作者: xevin 时间: 2015-12-12 16:55

我看到的文献大部分是用流式细胞仪检测的，可以对荧光强度进行定量检测。测定细胞内ROS的量方法比较多，一般是能够和ROS反应生成有色或发荧光的物质。现在比较推崇用DCFH，DHR等流式细胞仪检测。试验的目的是为了检测细胞产生ROS的量，要研究药物对细胞功能状态的影响应该先加入药物处理。然后加入DCFH等，让他进入细胞内，然后激发ROS的产生。不知你说的药物是你要研究的药物，还是激发细胞产生ROS的药物。两药的目的不同加入的时间也不同。

作者: 嗅嗅 时间: 2015-12-12 16:55

我是准备用一种金属配合物处理细胞，这种物质就是ROS的产生剂，能够诱导细胞凋亡，我想检测凋亡过程中细胞内ROS水平的变化，应该先加入DCFH还是后加入呢？多谢啦
因为用流式不太方便，所以用荧光分光光度计测荧光强度，我看的有些文献是这种做法，不知两者结果差异有多大？

作者: moonlight 时间: 2015-12-12 16:55

这个得根据你的实验设计是要看多长时间的毒性。因为ROS的产生有时间变化，得在那个时间内做才可以，如有的在放入药物几分中就产生明显的变化，那就在荧光抚育以后加入药物
如果是加入药物几个小时以后观察变化，则要后用荧光抚育
这个是我实验的方法
1、  实验前将DCFH-DA荧光试剂用DMSO配成20MMOL/L,低温避光保存
2、  将细胞接种于24孔板，1ml/孔，3*105/ml, 培养板放入37℃,5%CO2饱和湿度的培养箱内培养24小时.
3、
4、  24小时后,抽出培养液,PBS洗两次,每次5分钟,加入药物，
5、  孵育完毕后取出细胞, PBS洗细胞两次，每次5分钟，
6、  将荧光试剂用无血清培养基稀释成终浓度50umol/l，每孔加入1ml，37℃,，95％ O2, 5%CO2, 孵箱孵育1小时。
7、  吸出含荧光试剂的培养基,用0.25％胰酶消化细胞，当细胞脱落时加入含血清培养基中止消化，将细胞吸入玻璃管，离心，1000rpm， 5min, 用PBS洗三次,离心,1000rpm,5min.
8、  流式细胞检测，激发光488 发射光 525 ，至少检测5000个细胞。

作者: 嗅嗅 时间: 2015-12-12 16:55

多谢！有没有用过荧光分光光度计测DCFH荧光强度的朋友，交流些经验啊

作者: cocacola 时间: 2015-12-12 16:56

可以用共聚焦显微镜测量，而且可以动态实时对ROS进行检测，如果做时间点的分析，用共聚焦采集图像后，用相关的软件分析其荧光强度即可，如：Image-pro;Leica-QWin等

作者: whitesheep 时间: 2015-12-12 16:56

我想请教一下，
“孵育完毕后取出细胞, PBS洗细胞两次，每次5分钟” 为什么洗这么长时间？
吸出含荧光试剂的培养基之后，不需要用 pBS洗以去除未装载进细胞的探针吗？“将细胞吸入玻璃管”用塑料管可以吗？听说测试荧光最好不用塑料管，原因不知，另外，我用荧光分光光度计测ROS，本底值很高，是不是探针没有洗干净呢？

作者: ero11 时间: 2015-12-12 16:56

我准备做的实验方法：
将dcfh溶于无水乙醇，配成10mM的储液，用pbs稀释至1mM，过滤除菌，细胞进入对数生长期时在培养基中直接加入dcfh，终浓度10uM，37度30min，吸出培养基，用pbs洗3次，除去残留的dcfh，加入新鲜培养基，加入药物处理不同时间（30min，1h，2h，3h），收集细胞，pbs洗后制成细胞悬液，用荧光分光光度计检测荧光强度，激发488，发射525；或者涂片后直接在荧光显微镜上观察。
这样做法有没有什么问题，有经验的朋友多指出。

作者: BUK 时间: 2015-12-12 16:57

和我的思路大致差不多，我是用dmso溶的，也是用荧光分光光度计检测荧光强度，做了两次，结果不太好，正在改进中。

作者: BUK 时间: 2015-12-12 16:57

各位帮忙分析一下，我爬的片子怎么在荧光显微镜下发的是红色荧光，用绿色荧光激发为什么看不到？下面是对照

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=39465

作者: BUK 时间: 2015-12-12 16:57

下面是染毒组

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=39466

作者: 嗅嗅 时间: 2015-12-12 16:58

为什么是发红色荧光呢？应该是蓝光激发，发射出绿色荧光啊

作者: TNT 时间: 2015-12-12 16:58

我的用蓝光激发看不太清楚~但是用绿光激发，红色的荧光看的很清楚~

作者: 嗅嗅 时间: 2015-12-12 16:58

那可能不是dcfh的荧光，激发波长不对不能产生发射光，其它朋友的意见呢？

作者: BUK 时间: 2015-12-12 16:59

今天重做，增大dcfh剂量，有绿色荧光了~下面是对照

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=39467

作者: BUK 时间: 2015-12-12 16:59

下面是染毒了的。不过看片子之前没有用pbs洗，背景不是很好~

图片附件: 69192931.snap.jpg (2015-12-12 16:59, 17.19 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=39468

作者: 嗅嗅 时间: 2015-12-12 16:59

今天又做了一次，加药物处理3个小时，换新鲜培养基后12小时，然后在培养基中加入dcfh ，终浓度10uM，37度30min，胰酶消化收集细胞后，pbs洗一次，制成pbs悬液，在荧光光度计上检测，结果还是没发现荧光峰，真是郁闷，不知道是什么地方出了问题，难道是药品的问题？或者是不能在培养基中直接加入dcfh？

作者: vcve 时间: 2015-12-12 17:00

为什么药物处理3小时后还要换新鲜培养基12小时，不过好象ROS 的确不容易测，我是用酶标仪测的，摸了很多条件还搞不定，如果楼主成功了，希望能分享一下你的经验，祝好运！
对了，你们用荧光分光光度计测能做到量化吗，浓度组间怎么区分呢！

作者: 嗅嗅 时间: 2015-12-12 17:00

我用荧光光度计做了2次，结果还可以，平行样之间差异比较小，处理组的荧光强度大概是对照组的两倍，考虑到处理组细胞量要少些，它们之间的差异应该更大。不过定量确实是个问题，我是测定细胞的总蛋白量来定量，但是感觉这个方法误差比较大。
还是用流式做最好。

作者: redbutterfly 时间: 2015-12-12 17:00

有没有用过荧光分光光度计测DCFH荧光强度的朋友，交流些经验啊

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不用裂解细胞，我问过碧云天试剂公司了。我们做过了荧光酶标仪，跟分光光度计差不多的。
我今天做了一次就按其说明书做的，但最后一步用PBS洗3遍，洗掉探针，好像比以前结果好。我们也在摸索中，欢迎指正！

作者: redbutterfly 时间: 2015-12-12 17:01

之后的结果又是没有趋势了，结果很差。

作者: 33号 时间: 2015-12-12 17:01

你好，我最近也想测细胞内ROS,我们实验室没有荧光酶标仪，所以只能用荧光显微镜看一下了，我的贴壁细胞是种在24孔板里，用DCFH-DA温孵完后，是不是可以不消化直接拿到显微镜下观察？24孔板一定要是黑色的吗？为什么呢？

作者: ukonptp 时间: 2015-12-12 17:01

你好，我最近也想测细胞内ROS,我们实验室没有荧光酶标仪，所以只能用荧光显微镜看一下了，我的贴壁细胞是种在24孔板里，用DCFH-DA温孵完后，是不是可以不消化直接拿到显微镜下观察？24孔板一定要是黑色的吗？为什么呢？

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