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标题: 【求助】流式细胞术问题 [打印本页]

作者: windboy 时间: 2015-12-12 21:05 标题: 【求助】流式细胞术问题

请问哪位知道，做流式细胞术检测时，到上流式细胞仪分析之前的步骤是什么，怎么做、需要什么试剂之类的

作者: 49888 时间: 2015-12-12 21:05

QUOTE:

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请问哪位知道，做流式细胞术检测时，到上流式细胞仪分析之前的步骤是什么，怎么做、需要什么试剂之类的

你是用流式分析什么，如果是做凋亡的话我可以给你发个步骤。

作者: windboy 时间: 2015-12-12 21:06

我是要分析人胚肺二倍体成纤维细胞。

作者: NBA 时间: 2015-12-12 21:06

不知道你是做凋亡呢
还是表面标记
还是胞内因子
给你Protocol参考下
表面分子标记是鉴定DC成熟程度和发挥细胞免疫功能的重要指标，本实验采用流式细胞的方法在DC培养成熟前后鉴定DC的表面分子标记，包括：HLA-DR、CD1α、CD80、CD83 、CD86；
二、试剂、材料和方法
1．试剂
1.1流式试剂
检测抗体：
HLA-DR -FITC，BD公司Cat No：555811；
CD1α-PE，BD公司Cat No：555807；
CD80- PE-CY5，BD公司Cat No：555682；
CD83 -PE，BD公司Cat No：556855；
CD86 -FITC，BD公司Cat No：555657；
同型对照抗体：Mouse –FITC ，BD公司Cat No：555748、Mouse -PE，BD公司Cat No：555749、Mouse - Mouse - PE-CY5，BD公司Cat No：555750。
1.2 其它试剂
完全RPMI 1640(Hyclone)，添加10%经热灭活的胎牛血清（FBS,Hyclone）含青霉素100U(Sigma），链霉素100μg /ml（Sigma）；1xPBS经过高压灭菌；细胞洗涤buffer：含2%FBS的PBS，4℃储存；0.02%EDTA的PBS。
2．材料
12×75mm 6ml的Falcon管（BD Ca No.352052）；15、50ml的聚丙烯管（Falon）；5ml锥形12×75mm锥形聚苯乙烯管（VWR）；5°斜面培养架；10µL枪头、200µL枪头、1ml枪头、1.5ml离心管、15 ml离心管适量。
3．仪器
37℃孵箱5％CO2、混匀振荡器、离心机、加样枪、BD FACS流式细胞仪。

作者: NBA 时间: 2015-12-12 21:06

三.  实验方法
1.  细胞的收集、准备
分别在分离培养黏附获得单核细胞时即培养D0天和DC刺激成熟后D10或者D12天收集细胞，收集入离心管以1000RPM/mins离心10mins沉淀细胞，弃上清，加入3～4ml预冷的PBS(含2%FBS)，振荡混匀，离心沉淀；弃上清，每管加入1ml PBS（含0.02%EDTA），振荡分散细胞团后37℃孵育细胞悬液15mins，将细胞团充分分散；加预冷的PBS(含2%FBS)洗涤，混合后1000RPM/mins离心10mins，弃上清，留下约300μl溶液，轻轻拍散细胞，计数并调整细胞浓度至2×106cells/ml，分为50μl /管，共6管细胞悬液编号备用。该步骤计数时需要用台盼蓝染色检测细胞活力是否达到90%，否则死细胞会非特异地结合到抗体上的影响检测结果。
2.  流式检测步骤
DC成熟表面分子流式检测
分为两管，采用多标记染色进行检测。
1号检测管：检测HLA-DR、CD1α和CD80分子，分别在D0天和D10天收集细胞并调整至上述细胞浓度和体积后，取细胞悬液管加入流式单克隆抗体，同时加入HLA-DR -FITC，CD1α-PE和CD80- PE-CY5的流式单克隆抗体，4℃避光孵育30mins，用1ml的PBS溶液离心洗涤两次，加入2%多聚甲醛100μl重悬细胞并固定20分钟； 4号对照管：同时设置PE、FITC和PE-CY5标记的抗鼠IgG作为流式的同型阴性对照，上述细胞悬液同时加入同型对照抗体10μl，处理方法同前，流式细胞仪检测；
2号检测管：检测CD83和CD86分子，分别在D0天和D10天收集细胞并调整至上述细胞浓度和体积后，取细胞悬液管加入流式单克隆抗体，同时加入CD83 –PE和CD86 –FITC，4℃避光孵育30mins，用1ml的PBS溶液离心洗涤两次，加入2%多聚甲醛100μl重悬细胞并固定20分钟； 6号对照管：同时设置PE、FITC标记的抗鼠IgG作为流式的同型阴性对照，上述细胞悬液同时加入同型对照抗体10μl，处理方法同前，流式细胞仪检测.
四、结果表示
以表面分子阳性百分比（％），即含上述各表面分子阳性细胞所占细胞总数的百分数来表示。
五、附BD FACSA流式细胞仪检测操作规范

作者: NBA 时间: 2015-12-12 21:07

再给你流式细胞仪的使用方法参考
流式细胞仪的使用程序
一．开机程序
1．  检查稳压器电源，打开电源，稳定5分钟。
2．  打开储液箱，倒掉废液, 并在废液桶中加入400ml漂白水原液。打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至4/5满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFlow），合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。
3．  将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY，预热5－10分钟。排出过滤器内的气泡。
4．  如果需要打印，打开打印机电源。
5．  打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。
6．  执行仪器PRIME功能一次，以排除Flow cell中的气泡。
7．  分析样品时，先用FACAFlow 或PBS进行HIGH RUN约2分钟。
。做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml离心管，不接通浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。
二．  预设获取模式文件(Acquisition Template Files)
1．  从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个获取模式文件。
2．  选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot，绘出一个或多个Dot Plots（点图）。从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源，并确定适当的x轴和y轴参数。
3．  选取屏幕左列绘图工具中的Histogram，同上法可绘出Histogram（直方图）。
4．  将此视窗命名后储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder \EXP文件夹中，下次进行相同实验时可直接调用。
. 本计算机中已设定两个模式文件：ACQ和EXP，储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \EXP文件夹中，ACQ用于细胞DNA检测，EXP用于细胞表面标志分析。

作者: NBA 时间: 2015-12-12 21:07

三．  用CELLQuest进行仪器的设定和调整
1．  从苹果画面中选取CELLQuest，进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件。
2．  从屏幕上方Acquire指令栏中，选取Connect to Cytometer（快捷键：＋B）进行电脑和仪器的连机。将出现的Acquisiton Control对话框移至合适位置。
3．  从Cytometer指令栏中，开启Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status等四个对话框，并将它们移至屏幕右方，以便获取数据时随时调整获取条件。也可以用 +1，2，3，4获得此四个对话框。
4．  在Detectors/Amps对话框中，先为每个参数选择适当的倍增模式(amplifier mode)：线性模式Lin或对数模式Log。一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时，FSC和SSC多以线性模式Lin测量，且DDM Param选择FL2，而FL1, FL2与FL3则以对数模式Log测量；分析细胞DNA含量时，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3皆以Lin进行测量，且DDM Param选择FL2；分析血小板表型时，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3等均以Log进行测量。
5．  放上待检测的样品，将流式细胞仪设定于RUN，流速可在HIGH 或LOW上。
6．  在Acquisiton Control对话框中，选取Acquire，开始获取细胞。在以下的仪器调整过程中随时选取Pause，Restart以观察调整效果。未完全调整好之前不要去掉SETUP前的“”。
7．  在Detectors/Amps对话框中，调整FSC和SSC探测器中的信号倍增度：PMT voltages（粗调）与Amp Gains（细调），使样品信号出现在FSC-SSC点图内,且三群细胞合理分布。
8．  在Threshold 对话框中选择适当的参数设定Threshold，并调整Threshold的高低，以减少噪音信号（细胞碎片）。一般做细胞表型时用FSC－H而做DNA时用FL2－H。Threshold并不影响检测器对信号的获取，但可改善画面质量。
9．  从屏幕左列绘图工具中选取Region（区域），并在靶细胞周围设定区域线，即通常所说的门。圈定合适的细胞群可使仪器调整更为容易。
10．  在Detectors/Amps对话框中，调整荧光检测器（FL1, FL2, FL3, FL4等）的倍增程度。根据所用的荧光阴性对照样品调整细胞群，使之分布在正确的区域内。
11．  在Compensation对话框中，根据所用的调补偿用标准荧光样品调整双色（或多色）荧光染色所需的荧光补偿。比如应该为FL1+ FL2- 的细胞群却分布在FL1＋ FL2＋区域内，则需调大FL2－？％FL1中的“？”，并从FL1-FL2点图中观察新的调整是否恰当
12．  在Status对话框中可见：Laser Power:正常值—Run/Ready为14.7mW，Standby为5mW；Laser current:正常值为6Amps左右。
13．  调整好的仪器设定可在Instrument Settings对话框中储存，下次进行相同实验时可调出使用，届时只需微调即可。
. 本计算机中已有三个名叫储存于FACStation G3 \BD Applications \CELLQuest Folder \IMM-InstrSettings及FACStation G3 \BD Files \Instrument Settings Files \CalibFile和Mast-Cell-Set的参数文件，前二者可用于分析人白细胞，后者用于分析小鼠肥大细胞。
四．  通过预设的获取模式文件进行样品分析
1．  从苹果标志中选择CELLQUEST，新视窗出现后从File指令栏中选择Open，打开预设的获取模式文件。
2．  从屏幕上方Acquire指令栏中，选取Connect to Cytometer进行电脑和仪器的连机。将出现的Acquisiton Control对话框移至合适位置。
3．  从Cytometer指令栏中选取Instrument Settings，在其对话框中选择Open以调出以前存储的相同实验的仪器设定，按Set 确定。
4．  在Acquire指令栏中，选择Acquisition&Storage决定储存的细胞数，参数，信号道数。其中Resolution在做细胞表面标志时选择256，做DNA时选择1024。Parameter Saved…则根据不同的检测对象选择不同的参数。
5．  在Acquire指令栏中，选择Parameter Description，以决定文件存储位置(folder)，文件名称(file)，样品代号以及各种参数的标记(panel)，即安排tube1，2，3…的检测参数。一般本仪器获取的数据按照检测对象的不同分别储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \IMM 和DNA 文件夹中。文件根据日期命名。
6．  在Cytometer指令栏中，选择Counters，将此对话框移至合适位置，以便于随时观察events计数。
7．  将样品试管放至检测区，在Acquire Control对话框中选取Acquire以启动样品分析测定。
8．  微调仪器设定，待细胞群分布合适后选择Acquire Control对话框中Pause, Abort, 去除Setup前的“”，开始正式获取信号，存储数据。
9．  当一定数目的细胞被测定后，获取会自动停止，并会自动存储数据。重复步骤7，继续分析下一个样品，直到所有的样品数据分析完毕。
. 当所有样品分析分析完毕，即换上三蒸水，并将流式细胞仪置于“STANDBY”状态，以保护激光管。
五．  关机程序：
1．  从File中选择Quit, 退出软件，选择Don’t Save至苹果屏幕。
2．  用4ml 1：10稀释的漂白水作样品，将样品置于旁位（vacuum is on），以外管吸去约2ml，在将样品架置于中位（vacuum is off），再HIGH RUN 5分钟（内管吸去2ml）。
3．  改用三蒸水4ml作样品,同上处理。
4．  按Prime三次。
5．  此时仪器自动转为STANDBY状态，换2ml三蒸水。必须在仪器处于“STANDBY”状态 10分钟后再依次关掉计算机、打印机、主机、稳压电源，以延长激光管寿命，并确保应用软件的正常运行。
6．  填写使用登记表。

作者: windboy 时间: 2015-12-12 21:07

忘了说，主要是分析细胞周期

作者: kulee 时间: 2015-12-12 21:08

流式检测细胞周期最常用的方法是PI染色法。
这种方法比较常规，网上搜一下应该有很多资料的。
1、制备单细胞悬液。
2、70%乙醇固定。
3、加RNA酶去除RNA的干扰。
4、标记PI染料。
5、流式上样分析。

作者: duoduo 时间: 2015-12-12 21:08

相关疾病：
白血病

再给你流式细胞仪的使用方法参考
流式细胞仪的使用程序
一．开机程序
………………”
您好，想请教一下avivaqqqq大侠，和各位大侠，
请问一下我们实验室的流式细胞仪是Beckman ，型号 EpicsXL /XL-MCL,主要做白血病免疫分型。
我自己的实验要做的流式标本在机子上检测不出来荧光，不知道为什么。
系统第一、四通道荧光分别是FITC,PC-5,
我用的荧光染料是FITC和PerCP，双染的标本在机器上跟阴性标本是一样的。
非常郁闷。
请各位指点，多谢！

作者: windboy 时间: 2015-12-12 21:08

那个乙醇要用多少度，还有PI的浓度呢，我在网上看到有好几种浓度，究竟要用哪一种

作者: 2541 时间: 2015-12-12 21:09

请问哪位知道用流式分析细胞表面受体要注意什么啊？除了有阴性和阳性对照外要加同型对照吗？谢谢！

作者: eve_49 时间: 2015-12-12 21:09

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原帖由 2541 于 2015-12-12 21:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问哪位知道用流式分析细胞表面受体要注意什么啊？除了有阴性和阳性对照外要加同型对照吗？谢谢！

当然最好有同型对照了。
同型对照就是最好的阴性对照。
如果抗体没有问题的话，不需要阳性对照。

作者: milkdog 时间: 2015-12-12 21:10

请问哪位知道用流式分析细胞表面受体要注意什么啊？除了有阴性和阳性对照外要加同型对照吗？谢谢！

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一定要同型对照，这是最基本的要求，也是最重要的阴性对照。
所谓空白阴性对照是调整机器参数的阴性对照；而你做实验的阴性对照组那是实验的阴性对照；而同型对照是你做实验的系统对照，是你排除实验体系中非特异性染色的唯一对照。
同型对照是你做流式分析时划分阳性区的唯一标准，没有的话，你的阳性区域就是不可靠的。
如果不做同型，你的数据就是不可靠的。

作者: redbutterfly 时间: 2015-12-12 21:11

当然最好有同型对照了。
同型对照就是最好的阴性对照。
如果抗体没有问题的话，不需要阳性对照。

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I have read some article about flow cytometry, which says that isotype control is not the most suitable control. More and more papers recommend to use FMO( fluorescence minus one) control.

作者: 49888 时间: 2015-12-12 21:12

FMO对照是一个非常特殊的对照，并不是常规对照，应用于相对比较特殊的情况。
FMO对照与同型对照是从不同角度对于对照的分类，两者没有可比性，更不存在哪个好，哪个不好。
同型对照是最好的阴性对照这个是不会有错的。

作者: 6327555 时间: 2015-12-12 21:12

那我在同型对照和阴性对照中是不是直接选同型对照就可以了呢？

作者: 8s5g 时间: 2015-12-12 21:12

是的。

作者: tie8 时间: 2015-12-12 21:13

如果要染胞内因子呢？

作者: windboy 时间: 2015-12-12 21:13

QUOTE:

原帖由 tie8 于 2015-12-12 21:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

如果要染胞内因子呢？

你想问什么？
是想问检测胞内因子需要什么对照吗？
当然同样是同型对照了。

作者: 65urh 时间: 2015-12-12 21:14

那我在同型对照和阴性对照中是不是直接选同型对照就可以了呢？
有阴性对照，优先选择阴性对照而不是同型对照，阴性对照是指样品，同型对照是指试剂。

作者: rfv 时间: 2015-12-12 21:16

阴性对照是指不加任何试剂，而同型对照是指样品中加入同型对照抗体，广意上来说同型对照是阴性对照的一种。
不加任何试剂的阴性对照和同型对照之间，优先选择同型对照，因为正式实验或者说你放到文章上的数据要求有同型对照的。不加任何试剂的阴性对照可以作为预实验使用。

作者: okhaha 时间: 2015-12-12 21:17

流式检测细胞周期最常用的方法是PI染色法。
这种方法比较常规，网上搜一下应该有很多资料的。
1、制备单细胞悬液。
2、70%乙醇固定。
3、加RNA酶去除RNA的干扰。
4、标记PI染料。
5、流式上样分析。
......

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请问流式细胞术染细胞表面及细胞内因子必须要固定吗？

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