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标题: 【求助】磁珠分选 [打印本页]

作者: 子衿青青 时间: 2015-12-12 21:53 标题: 【求助】磁珠分选

求助各位战友，美天旎免疫磁珠分选buffer具体的配制？还有就是我用MS柱，如果细胞总数小于10×7是不是依然用500ul重悬细胞过柱？MS柱在无菌的情况下是不是可以重复利用？非常感谢

作者: october7 时间: 2015-12-12 21:54

可能这位同行没细看美天旎的磁珠分选的Protocol，上面有具体的buffer的配制方法，我要是没记错的话，应该是PH=7.2的PBS+0.5%的BSA+2mM的EDTA，如果你再仔细看的话，buffer的配制下面还有一个Note，上面写了人血白蛋白可以用其他一些蛋白代替，比如人血白蛋白、胎牛、小牛血清，而EDTA又可以用其他代替的！请仔细查看！
细胞总数少，还是要用500ul的buffer重悬的！个人认为磁珠分选，基础细胞量还是要多一点，10x7的细胞量并不是很多，不知道你要分什么细胞，如果你的阳性细胞比例不是非常高，这样你分出来的阳性细胞量就会很少，还有要是准备用这个阳性细胞细胞做下一步实验，细胞量会不够的，当然你仅仅做下预实验就另当别论了！
可能你还没有做过磁珠分选，这种MS柱是很容易被细胞堵住的，有时一次可能要用好几根柱子的！不晓得你说的“MS柱在无菌的情况下是不是可以重复利用？”是什么意思？是指MS柱分选完了后再消毒重新用？呵呵，我没这么做过，觉的行不通，因为MS柱最下面那个黑色的（应该算是铁制的吧）部分，里面都是高分子材料，允许细胞通过的空间不大啊，分选一次细胞，总会有细胞残留柱子里，这样就算能够下次重新用，那留给以后分选的细胞空间又会有多少呢？要是分选不同的细胞，是不是会造成细胞污染呢，虽然上次分选的细胞早已经死掉了！所以我建议还是不要重复用！

作者: october7 时间: 2015-12-12 21:55

磁珠分选的BUFFER我的柱子，也是自己配制得，就像楼上说的那样的方法，感觉也还好的。同意楼上的观点，MS柱子是很容易堵的，第一步选择建议还是用LD，这样的细胞的纯度会高些。

作者: 04906 时间: 2015-12-12 21:55

PH=7.2的PBS+0.5%的BSA+2mM的EDTA????没有具体比例啊战友，最近做的磁珠分选都失败了，怀疑Buffer配方有问题，请战友们指导，呵呵

作者: prettygirl@ 时间: 2015-12-12 22:01

PH=7.2的PBS+0.5%的BSA+2mM的EDTA????

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0.5%是指100ml里的浓度吗？2mM是什么意思啊？是怎么调的呢，能不能举例一下，非常感谢！

作者: 04906 时间: 2015-12-12 22:03

最近也想做人外周血的CD+8T细胞的免疫磁珠分选,Buffer的配制问题也有点不清楚，望有经验的师兄、师姐指点迷津，谢谢啦，

作者: yyaxw84 时间: 2015-12-12 22:03

QUOTE:

原帖由 prettygirl@ 于 2015-12-12 22:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
PH=7.2的PBS+0.5%的BSA+2mM的EDTA????

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0.5%是指100ml里的浓度吗？2mM是什么意思啊？是怎么调的呢，能不能举例一下，非常感谢！ ...

指的是2mmol/L，浓度。

作者: yyaxw84 时间: 2015-12-12 22:04

QUOTE:

原帖由 yyaxw84 于 2015-12-12 22:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

指的是2mmol/L，浓度。

0.5%的BSA: 0.5g BSA/100ml buffer

作者: yayya 时间: 2015-12-12 22:05

200mlPBS+1gBSA+0.148gEDTA即可，不用调PH

作者: dreaming 时间: 2015-12-12 22:06

呵呵，我们用MS和LD柱都是重复利用过十几次的，跟新柱子做过比对，木有差别。每次分选完用buffer反复冲洗柱子几遍后用无水乙醇冲洗几遍，再放入有无水乙醇容器里完全浸泡（一定要无水，不然就会生锈），等做完实验再拿出来把柱中的无水乙醇打出，放置到一个小铁饭盒里拿去高压灭菌，在放到干燥箱里干燥就可以了，下次用的时候再拿到超净台里打开铁饭盒，用无菌镊子取出继续利用

作者: dreaming 时间: 2015-12-12 22:06

切记不要用同一根柱子分选不同标记的细胞！

作者: 49888 时间: 2015-12-12 22:06

0.5%是指100ml里的浓度吗？2mM是什么意思啊？
0.5%是质量体积比，意思是100ml液体中加入0.5g BSA，2mM中mM一般是指mm/L是说每升中加入2mm(毫摩)。所以PH=7.2的PBS+0.5%的BSA+2mM的EDTA 配置是向1L pH 为7.2的PBS中加入5g(5g/L即每1000ml加入5gBSA，质量体积比为0.5/100)，加入2mmEDTA则是所需的Buffer

作者: tewank 时间: 2015-12-12 22:08

学习了，过一段我也要用美天旎磁珠分选细胞

作者: yapuyapu 时间: 2015-12-12 22:09

那个buffer用胎牛血清代替BSA，需要多大浓度，还是0.5/%么？

作者: 土坷垃 时间: 2015-12-12 22:10

呵呵，我们用MS和LD柱都是重复利用过十几次的，跟新柱子做过比对，木有差别。每次分选完用buffer反复冲洗柱子几遍后用无水乙醇冲洗几遍，再放入有无水乙醇容器里完全浸泡（一定要无水，不然就会生锈），等做完实验再拿出来把柱中的无水乙醇打出，放置到一个小铁饭盒里拿去高压灭菌，在放到干燥箱里干燥就可以了，下次用的时候再拿到超净台里打开铁饭盒，用无菌镊子取出继续利用?

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一次需要分选两个人，能否用同一个柱子？就是说能否中间用Buffer反复吹打洗净柱子？

作者: 土坷垃 时间: 2015-12-12 22:10

200mlPBS+1gBSA+0.148gEDTA即可，不用调PH

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EDTA固体吗？这种Buffer配完是不是需要0.22um滤网过滤呢

作者: 土坷垃 时间: 2015-12-12 22:11

那个buffer用胎牛血清代替BSA，需要多大浓度，还是0.5/%么？

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是的，按体积分数就行～

作者: 土坷垃 时间: 2015-12-12 22:11

0.5%是指100ml里的浓度吗？2mM是什么意思啊？
0.5%是质量体积比，意思是100ml液体中加入0.5g BSA，2mM中mM一般是指mm/L是说每升中加入2mm(毫摩)。所以PH=7.2的PBS+0.5%的BSA+2mM的EDTA 配置是向1L pH 为7.2的PBS中加入5g(5g/L即每1000ml加入5gBSA，质量体积比为0.5/100)，加入2mmEDTA则是所需的Buffer

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请问这buffer配一次能储存多久哈

作者: u76mp 时间: 2015-12-12 22:11

EDTA固体吗？这种Buffer配完是不是需要0.22um滤网过滤呢

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是EDTA粉末，要过滤除菌的

作者: 土坷垃 时间: 2015-12-12 22:13

QUOTE:

原帖由 u76mp 于 2015-12-12 22:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
EDTA固体吗？这种Buffer配完是不是需要0.22um滤网过滤呢

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是EDTA粉末，要过滤除菌的

谢谢啦，
我刚买了碧云天的ETDA液体，打算用0.22μm滤器过滤之后分装保存在无菌离心管中

作者: ukonptp 时间: 2015-12-12 22:13

关于buffer，美天旎有卖的呀～已经过滤除菌的

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