分析测试百科

标题: 请教：RNA提取和RT－PCR [打印本页]

作者: 园丁## 时间: 2011-10-4 10:44 标题: 请教：RNA提取和RT－PCR

请教：RNA提取和RT－PCR [转载]

我做了组织的RNA提取，过程很顺利，测OD值260nm/280nm=2.4，做RT－PCR，然后跑电泳，结果除了引物二聚体和RT－PCR试剂盒自带的阳性对照以外，没有β－actin出现，也没有目标产物的出现。请问结果怎么解释？
谢谢各位大侠！

作者: =菓子= 时间: 2011-10-4 10:45

出现这种情况的原因很多
首先,RNA是否降解,因为你的actin都没有出来；是否反转成功了你想要的cDNA,RNA不能说明问题，因为还要反转录，这个过程中也要防止RNA的降解，建议你的RNA跑一个电泳，看有没带出现。

作者: 韩梅梅 时间: 2011-10-4 10:45

你的内对照β－actin都没有出现PCR产物。可见你以前每个环节包括RNA抽提,RT,PCR都有可能有问题。
我的建议是:
1.所有要用的器具都严格用0.1%DEPC处理.
2.从RNA抽提,到RT,到PCR要一路做下来,别停,甚至可以不用测CD,更何况说RNA电泳.就是其他的战友说的那样要速战速决.RNA电泳看起来降解了,很多时候也可以作出RT-PCR的.
3.有时要注意PCR的条件，可以用一个带有目的片段的质粒DNA作PCR的阳性对照。
总之，RT-PCR要保证3个环节的成功,即RNA抽提,逆转录和PCR.如果你这3个过程都设计好阴\阳性对照,问题就很容易找出来了.而且，等你做出结果后，你就成为RT-PCR高手了.

作者: 喵咪 时间: 2011-10-4 10:46

RT我已经做了7年了。成功率现在为100％。现在建议如下：
1 一次性的耗材如果包装完整，没有必要进行灭RNA酶的处理。
2 楼上的朋友说的很对，速战速决很重要。
3 不要太担心RNA降解，尽量减少将标本置于37度左右温度环境。
4 RT过程中的RNA的变性很重要，置于冰水中的速度要快。其作用为打开RNA的二级结构。
5 PCR的反应条件很重要。如果上下游引物的TM值相差较远，可用touchdown的方法来做。
6 从你说的情况来看，RNA的降解并不是主要问题。
7 如果仍有问题，可将实验过程描述详细一点，我将尽快回答。

作者: fangxiang 时间: 2011-10-4 10:46

你好,鉴于你做RT很有经验,我想请问一下,如果RNA提取效果较好,反转录cDNA可以不用试剂盒吗?这笔钱可以省吗?对实验会有影响吗?我主要想做DDRT--PCR.你能和我联系吗?

作者: fangxiang 时间: 2011-10-4 10:47

请问喵咪：提取RNA要注意哪些问题?怎样做可以较好防止降解和污染?听说最好在冬天做,可是我的时间刚好赶到夏天,该怎么办?会有很大影响吗?谢谢回复!

作者: 冰激凌小姐 时间: 2011-10-4 10:47

我做了组织的RNA提取，过程很顺利，测OD值260nm/280nm=2.4，做RT－PCR，然后跑电泳，结果除了引物二聚体和RT－PCR试剂盒自带的阳性对照以外，没有β－actin出现，也没有目标产物的出现。请问结果怎么解释？
谢谢各位大侠！

============================================

OD值大于2.0，通常是RNA降解了，成为单核苷酸。重提吧。

作者: 冰激凌小姐 时间: 2011-10-4 10:49

你好,鉴于你做RT很有经验,我想请问一下,如果RNA提取效果较好,反转录cDNA可以不用试剂盒吗?这笔钱可以省吗?对实验会有影响吗?我主要想做DDRT--PCR.你能和我联系吗?谢谢!

================================

可以不用试剂盒，自己摸一下条件即可。

季节没关系的，实在不行，可以开空调嘛

作者: 喵咪 时间: 2011-10-4 10:50

谢谢你的信任！
不知道你用的是什么方法提取RNA.如果用的是TRizol，和天气是没有关系的。该溶液中含有RNA酶强抑制剂，没有那么容易降解。
一次性耗材如包装完整，是正规厂家生产，没有必有进行灭RNA酶的处理，会适得其反的。
到最后一步溶于DEPC处理的三蒸水后应该尽快进行RT.
RT过程中的RNA的变性比较重要，置于冰水的速度要快。
我昨天的帖子谈到过关于RT-PCR的问题，请查阅。

作者: 园丁## 时间: 2011-10-4 10:51

谢谢大家的关心！
我用的是RNA提取试剂盒。
昨天做了RNA电泳，没有RNA的三条代出现；今天又重新提取RNA（Tip头全重新用DEPC泡了，并高温消毒），并和以前有产物出现的RNA（保存于－70度，1 week）跑RNA电泳，都没有RNA三条代出现。（没有做RT－PCR）
现在考虑RNA试剂盒有问题，打算明天提取正常组织的RNA，看究竟是否有RNA提取出来。
你们觉得呢？
现在真是心力憔悴呀！
谢谢大家！

作者: 园丁## 时间: 2011-10-4 10:51

另外，我做RT－PCR是用的PCR仪（以前做出来过，应该RT－PCR过程没有问题），RNA提取过程也严格按照试剂盒说明书做的。

作者: 园丁## 时间: 2011-10-4 10:52

RT－PCR也是用的试剂盒（大连宝生物公司）

作者: 园丁## 时间: 2011-10-4 10:53

更详细的过程是：

试剂：RNA提取试剂盒（Promega公司）
RT－PCR试剂盒（大连宝生物公司）
PCR仪
过程：2004年3月12日－2004年3月22日
提取昆明鼠皮肤移植物RNA（组织大小约1cm×1cm）：液氮冻存10min，取出，碾钵碾磨，然后按照试剂盒说明书进行操作，测OD值，做RT－PCR，跑电泳，收集图像。
结果：有RNA提取出来，RT－PCR有结果
2004年4月2日－2004年4月7日
提取Balb/c→C57皮肤移植物（术后1天）RNA，步骤同前（260nm OD值 /280nmOD值＝2.0），结果查见没有β－actin的条代出现（有RT－PCR试剂盒自带的阳性对照条代出现）；将RNA提取物直接跑RNA电泳（电泳槽、电泳液等全部用DEPC处理），没有RNA的三条代出现。
再次提取Balb/c→C57皮肤移植物（术后3天）RNA，步骤同前（260nm OD值 /280nmOD值＝2.4），并与术后1天标本同时做RT－PCR，结果同前，（没有β－actin的条代出现，有RT－PCR试剂盒自带的阳性对照条代出现）。跑RNA结果同前（没有RNA的三条代出现）。
再次提取Balb/c→C57皮肤移植物（术后5天）RNA，步骤同前（但是没有测OD值和做RT－PCR），直接跑RNA电泳，没有RNA的三条代出现。
提取昆明鼠正常新鲜皮肤，步骤同前（没有测OD值），跑RNA电泳，没有RNA的三条代出现；做RT－PCR，有β－actin的条代出现。

现在考虑实验组没有RNA的缘故是组织细胞量太少，而正常组织的细胞量多故能够提取出来RNA。
请问是不是呢？
谢谢大家！

作者: mimili_901 时间: 2011-10-4 10:54

RT我已经做了7年了。成功率现在为100％。现在建议如下：
1 一次性的耗材如果包装完整，没有必要进行灭RNA酶的处理。
2 楼上的朋友说的很对，速战速决很重要。
3 不要太担心RNA降解，尽量减少将标本置于37度左右温度环境。
4 RT过程中的RNA的变性很重要，置于冰水中的速度要快。其作用为打开RNA的二级结构。
5 PCR的反应条件很重要。如果上下游引物的TM值相差较远，可用touchdown的方法来做。
6 从你说的情况来看，RNA的降解并不是主要问题。
7 如果仍有问题，可将实验过程描述详细一点，我将尽快回答。

======================================================================

对于第一条，想请问那种国产的有塑料扣封口的器材（包装完整）也可以不进行DEPC处理吗？
第四条，如果使用一步法试剂盒，是不是就不用考虑了？
我也是新手！不出结果！

作者: 花裙子 时间: 2011-10-4 10:54

你上面说：
从RNA抽提,到RT,到PCR要一路做下来,别停,甚至可以不用测CD,更何况说RNA电泳.就是其他的战友说的那样要速战速决.RNA电泳看起来降解了,很多时候也可以作出RT-PCR的.
这听起来很有道理！可如果不测OD，那RT-PCR反应体系中模板浓度怎么定呢？具体加多少样本呢？

作者: 碧空子 时间: 2011-10-4 10:56

最近我提了200多份组织RNA，算是有点经验了。我的标本一般离体后1～2小时内置于RNAlater中浸泡过夜，取出后置于－80度冰箱保存（一年都没关系）。用Invitrogen生产的Trizol抽提，方便又简单，这中间RNA沉淀后可保存于75%的DEPC水处理的乙醇置于－20度近一年。但一旦水融解RNA后应尽快逆转录。融解后测一下OD比值和浓度。逆转录就采用PROMEGA的MMLV逆转录酶进行逆转录反应，还没做目的基因的PCR，但用看家基因试了一下，还不错。实验刚开始觉得很难，现在觉得就那么回事。RNA酶并没有想象的可怕。OD比值2.4就太高了，应该在1.8~2.0。

作者: cute 时间: 2011-10-4 10:57

喵咪
看了你的回帖,受益非浅。您是RT高手，我现在也有这方面的问题特向你请教：我提脂肪组织RNA（用trizol法）,但几次都未成功,非常希望得到您的帮助,不知可否将如何提脂肪组织的RNA的具体操作过程及注意事项发送给我,非常感谢!

作者: 嗨皮 时间: 2011-10-4 10:57

我现在在做一种外来病毒的鉴定，因为是RNA病毒所以要用RT-PCR扩增特异的片段，引物我自己已经设计好了，那后续的工作怎么开展呢？
　　请教这方面的高手指教．谢了！

作者: 蝴蝶结子 时间: 2011-10-4 10:58

请教各位高手，我用 Invitrogen 的Trizol 和 Roche的 Tripure 提胎盘组织总RNA,共提了11次, 虽然产量和A260/A280都可以, 但RNA总有降解(18S的亮度超过28S,且18S以下有大片条带). 使用Promega的M-MLV用下游引物和Oligo dT逆转录的cDNA的分子量都在500bp以下(我的目的条带为2000bp左右), 用高保真Taq酶做 PCR的结果为500bp 以下的3条非特异性条带,改变模板浓度后仍未出现目的条带.
组织切下后即放入液氮,至今有2个月. 各种玻璃器皿和枪头都用DEPC浸泡过夜后高压灭菌. RNA提取后即逆转录,次日PCR.
真搞不懂问题在哪里.
渴望大家帮助!

作者: 岸上的鱼 时间: 2011-10-4 10:58

TO 喵咪：您好，请问：4 RT过程中的RNA的变性很重要，置于冰水中的速度要快。其作用为打开RNA的二级结构。这条是指在什么时候？我都没做过这一步。我是新手。

作者: purrr 时间: 2011-10-4 10:59

To 喵咪
我用 Invitrogen 的Trizol 和 Roche的 Tripure 提胎盘组织总RNA,共提了11次, 虽然产量和A260/A280都可以, 但RNA总有降解(18S的亮度超过28S,且18S以下有大片条带). 使用Promega的M-MLV用下游引物和Oligo dT逆转录的cDNA的分子量都在500bp以下(我的目的条带为2000bp左右), 用高保真Taq酶做 PCR的结果为500bp 以下的3条非特异性条带,改变模板浓度后仍未出现目的条带.
组织切下后即放入液氮,至今有2个月. 各种玻璃器皿和枪头都用DEPC浸泡过夜后高压灭菌. RNA提取后即逆转录,次日PCR.
等待您的回答。谢谢！

作者: purrr 时间: 2011-10-4 11:00

TO 喵咪：我用 Invitrogen 的Trizol 和 Roche的 Tripure 提胎盘组织总RNA,共提了11次, 虽然产量和A260/A280都可以, 但RNA总有降解(18S的亮度超过28S,且18S以下有大片条带). 使用Promega的M-MLV用下游引物和Oligo dT逆转录的cDNA的分子量都在500bp以下(我的目的条带为2000bp左右), 用高保真Taq酶做 PCR的结果为500bp 以下的3条非特异性条带,改变模板浓度后仍未出现目的条带.
组织切下后即放入液氮,至今有2个月. 各种玻璃器皿和枪头都用DEPC浸泡过夜后高压灭菌. RNA提取后即逆转录,次日PCR.
等待您的回答。谢谢！

[ 本帖最后由 purrr 于 2011-10-4 12:54 编辑 ]

作者: dreaming 时间: 2011-10-4 12:56

众位高手、大侠：

我提脂肪组织RNA（用trizol法）,但几次都未成功,非常希望得到各位的帮助,不知可否将如何成功提取脂肪组织RNA的具体、详细操作过程及注意事项发送给我,非常感谢!

作者: 花裙子 时间: 2011-10-4 12:56

你的比值太高了，RNA已经降解成小片段了，你是不是匀浆时没立即加TRIZOL

作者: @木木@ 时间: 2011-10-4 12:57

向各位高手请教一个很基础的问题：如何尽可能减少RNA中的DNA污染，又不破坏RNA的质量？先谢了！

作者: 不懂 时间: 2011-10-4 12:57

我做了脂肪组织RNA的提取，已经做了一个多月了，我用的是Qiagen mini kit，刚开始什么都做不出来，现在总算可以提出RNA了，但我不知道我提的RNA怎么样，附图（见附件），测了OD值为1.98,用的Qiagen的逆转录试剂盒做了逆转录,现在做pcr,只能扩出引物二聚体.
逆转录反应步骤如下:
RT反应:
注意：（1）对50ng～2ug RNA进行逆转录；
（2）将所有的反应在冰上进行，以防cDNApremature合成和减小RNA降解的危险。
（3）如果用oligo-dT引物,推荐用12个核苷酸,终浓度为1uM,当用随机引物时,推荐用9个核苷酸,终浓度为10uM.
操作步骤：
（1）  在冰上融解模板RNA。在室温（15～25℃）融解引物溶液（未提供），10×Buffer RT，dNTP Mix，无Rnase的水。融解后立即放在冰上。振荡器上振荡混匀，短暂离心以收集残留的贴壁的液体。
（2）  用冰冷的1×Buffer RT(用提供的Rnase-free水稀释10×BufferRT溶液获得)稀释Rnase inhibitor（未提供）到终浓度10 units/ul。振荡5s以下小心混匀，短暂离心以收集管壁残留的液体。
注：商品化的Rnase inhibitor一般是40 units/ul，稀释使下一步取少量的Rnase inhibitor时容易操作。要准备新鲜的Rnase inhibitor的稀释液。为了减少Rnase inhibitor和Buffer RT的用量，每次稀释不要超过逆的使用量。
（3）  Reverse-Transcription Reaction Components
Component Volume/reaction Final concentration
Master mix
10×Buffer RT 2 ul 1×
dNTP Mix (5mM each dNTP) 2 ul 0.5 mM each dNTP
Oligo-dT18 primer(0.5ug/uL) 1.5ul
Rnase inhibitor(10 units/ul) 1ul 10 units(per 20 ul reaction)
Omniscript Reverse Transcriptase 1ul 4units (per 20 ul reaction)
Rnase-free water 6.5
Template RNA
Template RNA,added at step 5 7 Up to 2 ug(per 20 ul reaction)
Total volume 20 ul －
彻底混匀小心vortex不超过5s，短暂离心以收集试管壁上的残留液体，放在冰上。
注：如果有4ugRNA模板则将反应体积按比例扩大为40ul。
（4）  加入模板RNA，彻底混匀小心vortex不超过5s，短暂离心以收集试管壁上的残留液体。
（5）  37℃孵育60min。
（6）取出一定量的反应产物加入PCR反应。可在冰上直接进行PCR反应，或放入－20℃长期保存。

作者: 不懂 时间: 2011-10-4 12:57

我提的RNA图片

图片附件: 78066546.jpg (2011-10-4 12:58, 7.46 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8640

作者: 不懂 时间: 2011-10-4 12:58

上面的是DNA marker,下面的是同一个样本,加量不同,我用的试剂盒提出来只有28S和18S两条带,对了,请问0.5ug/uL的oligo (dT)18换算成mol/L或者umol/uL等于多少,非常感谢.

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)