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标题: 请问：有关RNA提取和RT－PCR [打印本页]

作者: INK 时间: 2011-10-4 13:32 标题: 请问：有关RNA提取和RT－PCR

请问：有关RNA提取和RT－PCR [转载]

试剂：RNA提取试剂盒（Promega公司）
RT－PCR试剂盒（大连宝生物公司）
PCR仪
过程：2004年3月12日－2004年3月22日
提取昆明鼠皮肤移植物RNA（组织大小约1cm×1cm）：液氮冻存10min，取出，碾钵碾磨，然后按照试剂盒说明书进行操作，测OD值，做RT－PCR，跑电泳，收集图像。
结果：有RNA提取出来，RT－PCR有结果
2004年4月2日－2004年4月7日
提取Balb/c→C57皮肤移植物（术后1天）RNA，步骤同前（260nm OD值 /280nmOD值＝2.0），结果查见没有β－actin的条代出现（有RT－PCR试剂盒自带的阳性对照条代出现）；将RNA提取物直接跑RNA电泳（电泳槽、电泳液等全部用DEPC处理），没有RNA的三条代出现。
再次提取Balb/c→C57皮肤移植物（术后3天）RNA，步骤同前（260nm OD值 /280nmOD值＝2.4），并与术后1天标本同时做RT－PCR，结果同前，（没有β－actin的条代出现，有RT－PCR试剂盒自带的阳性对照条代出现）。跑RNA结果同前（没有RNA的三条代出现）。
再次提取Balb/c→C57皮肤移植物（术后5天）RNA，步骤同前（但是没有测OD值和做RT－PCR），直接跑RNA电泳，没有RNA的三条代出现。
提取昆明鼠正常新鲜皮肤，步骤同前（没有测OD值），跑RNA电泳，没有RNA的三条代出现；做RT－PCR，有β－actin的条代出现。

现在考虑实验组没有RNA的缘故是组织细胞量太少，而正常组织的细胞量多故能够提取出来RNA。
请问大家这样分析对不对呢？

谢谢大家！

作者: 8黑眼圈8 时间: 2011-10-4 13:34

只能说明你的RNA提的太臭!
连管家基因都没有,那就是RNA没有提到,至于有阳性对照,只能说明你的反转录与PCR过程没有问题!
正常组织提的RNA也不行,有降解,但由于管家基因丰度很高,所以还是有条带!

作者: 冰激凌小姐 时间: 2011-10-4 13:34

看了你的问题，我考虑没有别的原因，只可能是你提RNA的过程中有RNA酶污染而使RNA降解了，所以你再次提的时候一定要注意污染的问题，所有接触RNA的器具都要用DEPC水处理过高温烤干，超净台要消毒后才用，另外戴口罩和手套也很重要。你如果实在没有把握的话，你可以先跟其它会提的人学一下。

作者: 椰子叶子 时间: 2011-10-4 13:36

楼主用的是不是Takara的Catrimox-14?
如果是的话，我曾用过这个DD，
感觉得率和Protocol说的有很大的出入，
而且Catrimox-14的获率太低，
与同样1ml的TRIZOL相比，前者获取细胞的量只有后者的1/10
此外，Catrimox-14最好在常温下使用，
不要加Catrimox-14在-80'c超过两个星期－倒不是RNA降解，而是OD260/OD280比值太低,曾经让我郁闷ing半个月．
碾钵碾磨加TRIZOL或Catrimox-14研磨，这很重要

希望对你有用

作者: +田田+ 时间: 2011-10-4 13:36

强烈推荐Trizol，
昨天刚刚提取的rat的十种不同器官的RNA，用的就是trizol,
A260/A280都在2.2以上。

另外，在碾钵里加trizol碾碎是，要经常加液氮，防止融化，
碾成冰淇淋状后，呵呵，要放至液体变色至澄清后再转移到离心管中

作者: 开心蔬菜帮 时间: 2011-10-4 13:36

A260/A280都在2.2以上。

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降解了

作者: INK 时间: 2011-10-4 13:38

好像根据晶美公司的介绍，A260/A280大于2.2是“水解成单核酸”了，我不知道“水解”和“降解”有区别否？

作者: 不懂 时间: 2011-10-4 13:40

强烈推荐Trizol，
昨天刚刚提取的rat的十种不同器官的RNA，用的就是trizol,
A260/A280都在2.2以上。

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你的结果令我很恐怖！！我成功的提取了RNA，但从来没有你的这个比值！如果使用DD水溶解RNA该比值要小一些。但要用BUffer溶，该比值可能在1.8以上，前提是提取的较好。个人见解

作者: INK 时间: 2011-10-4 13:40

首先谢谢大家！
不过，唉，我又提了几次RNA，只要一做昆明鼠的就有结果，一做Balb/c→C57的OD比值就偏大，就没有结果。苦恼ing！

作者: 胖小妮子 时间: 2011-10-4 13:41

我用Invitrogen的TRizol从组织里面提取过100多例的RNA，A260/A280都在1.8左右，最大不超过1.9，最小没有低于1.75，水浴助溶的A260/A280比值稍偏大一些。

作者: 魔法师A 时间: 2011-10-4 13:43

楼上各位各抒己见，在下深表同意，有点点个人体会不妨跟大家共享，望批评指正。固然液氮保护下研磨是RNA不降解的最有力的保证，可是也有不易操作的缺点，就我做来的经验，一旦经液氮冷冻，组织就会变得坚硬无比，研磨起来颇有难度，而且尽管小心再小心，弄不好还是会碎屑飞溅，损失一些。或者是我操作的不对，因为一直以来本人都是摸着石头过河，没有机会观摩他人的操作，在这里如果能够得到哪位战友的指点，将不胜感激。言归正传，我认为是否有液氮保护可视组织的质地而定。比如，我第一次提取组织RNA遇到的就是硬骨头，没有办法，只好用液氮了，效果不错；后来轮到软的组织，也如法炮制，发现一旦入了液氮，竟然变得和骨头一样的坚硬，这样岂不是辜负了人家起初的天生软质，试着改成加入TRIzol后匀浆的办法，结果出来也很好，有图像为证（左为液氮法，右为改良法），而且提到的量也较多，主要是省事了许多。我们这里有人提取肾的RNA，不需液氮效果也不错。

作者: INK 时间: 2011-10-4 13:43

好像对于肾脏、肝脏等软组织是可以不用液氮。
但我做的是皮肤呀？！只有用液氮咯？

作者: 金手指 时间: 2011-10-4 13:44

为什么非要用液氮研磨呢？需要说明的是液氮主要起快速冷冻的作用,RNA在低温时不降解!!!不论任何组织或细胞的提取液都不是液氮,而是Trizol。而且液氮确实不好研磨，蒸发快，所以不能保证RNA的不降解。所以个人认为最好的方法是组织（包括皮肤哦）直接在Trizol里研磨。接着继续进行抽提！

作者: 雷子! 时间: 2011-10-4 13:45

强烈推荐Trizol，
昨天刚刚提取的rat的十种不同器官的RNA，用的就是trizol,
A260/A280都在2.2以上。

好像是降解了！

作者: 缘yuan 时间: 2011-10-4 13:46

弱弱地问：trizol 是什么试剂？在RNA提取中起啥子作用啊？

作者: INK 时间: 2011-10-4 13:47

我也想请问trizol 是什么试剂？hansontcm战友所说的“Takara的Catrimox-14”又是什么试剂？它们都是提取RNA的试剂吗？那我用的Promega公司的RNA提取试剂盒，说明书上怎么没有提及“trizol 试剂”呢？哪位大哥可以给我解释一下，谢谢！

另外，我查找文献，发现好像没有谁用Balb/c的皮肤做过RT-PCR，不知道这是不是真的。请问有谁发现过这方面的文献吗？谢谢！

作者: INK 时间: 2011-10-4 13:50

“为什么非要用液氮研磨呢？需要说明的是液氮主要起快速冷冻的作用,RNA在低温时不降解!!!不论任何组织或细胞的提取液都不是液氮,而是Trizol。而且液氮确实不好研磨，蒸发快，所以不能保证RNA的不降解。所以个人认为最好的方法是组织（包括皮肤哦）直接在Trizol里研磨。接着继续进行抽提！”

好像说得有道理吔！

作者: @花开花落@ 时间: 2011-10-4 13:50

我也想请问trizol 是什么试剂？hansontcm战友所说的“Takara的Catrimox-14”又是什么试剂？它们都是提取RNA的试剂吗？

Takara的Catrimox-14是RNA Isolation Kit 中的一个组分，他是一种裂解液、还有变性的作用，有助于裂解细胞，同时Catrimox-14还可以结合RNA形成一种稳定的复合物，接下来除去不需要的物质，剩下Catrimox-14-RNA再从中提取RNA。trizol 也是一种裂解液，他是intrivogen公司的产品，非Promega产品。

作者: 扑啦啦 时间: 2011-10-4 13:53

我用Takara的Catrimox-14提贴壁细胞也没提出来，不过在原因未分析清楚之前我不想随便臧否Takara的产品，毕竟以前用过不少Takara的产品都还是不错的。

我是这样操作的：先用胰酶将细胞消化下来，用PBS洗涤后，去掉PBS，加入Catrimox-14，可是在加LiCl之前就没看到沉淀，因为在加入LiCl之前DNA及各种杂蛋白都还在，应该能看到沉淀的。逆转录PCR没P出来，但是对照RNA P出来了，说明逆转录和PCR都是没问题的，唯一的问题就是RNA没提出来。

提RNA的操作和所用的枪头管子都没有问题的，因为我又不是第一次提了，我不知道是不是不应该用胰酶消化，因为TRIzol的说明书上说提贴壁细胞时先倒掉培养液，然后直接将TRIzol加到瓶子里裂解细胞。

还请有经验的兄弟看看我的分析有没有道理啊！

作者: INK 时间: 2011-10-4 13:54

"Takara的Catrimox-14是RNA Isolation Kit 中的一个组分，他是一种裂解液、还有变性的作用，有助于裂解细胞，同时Catrimox-14还可以结合RNA形成一种稳定的复合物，接下来除去不需要的物质，剩下Catrimox-14-RNA再从中提取RNA。trizol 也是一种裂解液，他是intrivogen公司的产品，非Promega产品。 "

那Promega用的又是什么呢？I don't know.

作者: 圆圆圈圈 时间: 2011-10-4 13:54

你的结果令我很恐怖！！我成功的提取了RNA，但从来没有你的这个比值！如果使用DD水溶解RNA该比值要小一些。但要用BUffer溶，该比值可能在1.8以上，前提是提取的较好。个人见解

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弱问一下，dd水是什么，depc水么。一般比值大概是多少，大于或者小于这个比值意味着什么，3x

作者: 果冻也酸 时间: 2011-10-4 13:54

我也向大虾们问一个弱智问题，我用的是Promega 的Access RT-PCR system，但我有两个问题不清楚：1.我的试剂盒里为什么没有Rnasin；2.说明书上也没有说在做RT时，要先70℃5min，是不是不需要呀；3.阳性对照怎么用呀，是不是每次都做呀，可那岂不是很浪费试剂，我的总共才20个反应，还有对照和样品也不能一块P吧，因为他们的Tm值毕竟不一样呀！马上就要做了,郁闷ing!!请高手们指点呀！

作者: 微笑的海豚 时间: 2011-10-4 13:55

理论上纯的RNAOD260/OD280的值为2.0，实际实验过程中由于多方面因素的影响，真正抽提比较好的比值一般为1.7~1.9。造成比值低于1.6的原因主要包括：
1用于样品匀浆的Trizol量太少（一般50~100mg组织加入1mlTrizol)
2在进行分光光度计测量时，用了酸性的水溶解了RNA
3液相转移时水相被苯酚相污染
4最终RNA沉降物溶解不完全
5匀浆后样品未在室温下放置5分钟
至于楼上某些站友称自己RNA的OD比值大于2,本人认为一定是RNA降解了，其实RNA溶解在DEPC处理水的那一步中，55-60度水浴10分钟或者常温下用加样枪吹打几下都有助于RNA的溶解和提高OD比值

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