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标题: 求助：RT-PCR引物设计 [打印本页]

作者: 二丫头466 时间: 2011-10-4 15:57 标题: 求助：RT-PCR引物设计

求助：RT-PCR引物设计 [转载]

以前一直认为引物设计比较复杂，但是这次自己设计了一个，感觉不是很麻烦。
也就是将CDNA序列输入软件中，然后选择引物就行了。因为我要作的只是检测基因的表达，是不是就没有其他什么要考虑的了？

作者: 蛐蛐儿 时间: 2011-10-4 15:59

是啊！你的目的只是检测基因的插入就非常简单了，你那样做就可以了。

作者: 大仙 时间: 2011-10-4 15:59

我认为二丫头466 还应再将引物序列Blast一下，查看一下引物特异性，如果特异性不好，可能出现几条带。须排除的两个问题
1引物是否与多个目的基因同源。如果有同源基因，说明引物特异性不好，需要重新目的基因的特异片段设计引物。
2如果没有同源基因，还得看一下你的目的基因有无变异体，如果没有最好。如果有则可能出现几条变异体带。如果要设计一条带，须看引物是否设计在几个变异体的共同序列内。如果不是，则要重新设计。
可以参看以下帖子
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=893007&sty=1&tpg=1&age=0')

作者: 二丫头466 时间: 2011-10-4 16:00

不好意思,Blast是怎么回事,小妹太菜,没有听说过
谢谢!

作者: 冰激凌小姐 时间: 2011-10-4 16:00

Blast好象是比对的意思，就是将你的引物序列输入软件里面，结果看引物与你查的CDNA序列是否配对，即特异性情况，还可以看你的引物自身配对情况等一些参数。具体的软件有DNAman 及DNAstar等

作者: 二丫头466 时间: 2011-10-4 16:01

我是用primer 5.0设计的，它自身就带有打分，而且给出关于设计出引物的情况。你们所说的blast 是用什么软件进行？

作者: 大猫 时间: 2011-10-4 16:02

我觉得pp5.0挺好用的，另外可以试一试：
cuturl('http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi')

作者: 二丫头466 时间: 2011-10-4 16:02

能不能把blast给我解释解释？谢谢了

作者: 去看海 时间: 2011-10-4 16:03

blast 就是将你的目的片段到网上去和所有的已经登录在上面的序列比较一下。就现在你设计引物来说，如果你的引物只和你要扩增的基因相配对（如我们在做溶菌酶基因，那么引物就必须只和溶菌酶基因相配对，而不能和其他如凝集素之类的相配对）那么就符合要求。BLAsT结果出来序列就是和你的目的片段能配对的序列，其顺序按同源性由高到低排列。如果出来的高同源性序列不只是你的目的基因种类，还有其他种类的基因，你的引物质量就不是太理想了。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-10-4 16:04

BLAST一般去NCBI的BLAST目录进行：
cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST'),
输入你的引物序列后，选search,然后选format,即可看到BLAST的结果。
很简单的噢！：）

作者: 二丫头466 时间: 2011-10-4 16:05

你说的是cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/')吧！
引物序列输入哪里呢？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-10-4 16:05

你说的是cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/')吧！
引物序列输入哪里呢？

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cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?CMD=Web&LAYOUT=TwoWindows&AUTO_FORMAT=Semiauto&PAGE=Nucleotides&NCBI_GI=yes&FILTER=L&HITLIST_SIZE=100&SHOW_OVERVIEW=yes&AUTO_FORMAT=yes&SHOW_LINKOUT=yes')

作者: 二丫头466 时间: 2011-10-4 16:06

我已经BLAST了，但是结果看不懂

作者: 笔笔 时间: 2011-10-4 16:07

把两个引物，空上几格如GCTCTAGAAAATGAAGCAAACCTAT ACGCCAGCTGCATATTTCTGAAATTCTAAT 然后blast,看看同源性最高的是什么。
空格的效果怎么在帖子上显不出来！算了，你懂我的意思就行了

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