分析测试百科

标题: PCR 95度完全变性10分钟后再Taq酶者请来交流一下 [打印本页]

作者: purrr 时间: 2011-10-5 17:19 标题: PCR 95度完全变性10分钟后再Taq酶者请来交流一下

PCR 95度完全变性10分钟后再Taq酶者请来交流一下 [转载]

本人摸索PCR近半月苦于没有结果或特异性条带瞪大眼才偶见，再改变了循环方式后轻松扩得特异性清晰条带，怪！可能是先加酶者酶衰减了。
95度 10min
94度 1min
56.5度 1min
72度 1min 30个循环
72度 10min

作者: 不懂 时间: 2011-10-5 17:20

不清楚楼主为什么要95度10min，你的模板有特别的地方吗，一般有3分钟就可以了，TAQ酶可以直接加进去，95度几分钟并不至于会出现实验出不来的情况，除非你的酶本身有问题。

作者: 胖小妮子 时间: 2011-10-5 17:21

95C，10分钟一般是用在TaqGold酶的，Gold的酶需要加热10-12分钟来激活。如果你是用一般的Taq酶是不需要这一步这么长的，否则Taq的活性反而会受损。而且，大家一般是在95C以后再加酶进行循环。不过我们用Gold类型的酶都是要加热激活，所以一开始就加进去一起反应。

作者: 椰子叶子 时间: 2011-10-5 17:21

95C 10min，是为了将基因组中的DNA尽量的完全变性，以使为数不多的目的序列得到扩增呀，这样做有没有用呀？
TaqGold酶是啥酶呀？俺没听说过呀

作者: coolcool 时间: 2011-10-5 17:22

TaqGold是经过化学修饰过的Taq酶，就比一般的Taq好，只有加热后才有活性，防止非特意扩增。

作者: ha111 时间: 2011-10-5 17:29

我见过一篇文章：95度15分钟进行预变性（Molecular Psychiatry （2000）5，531~536）。有些目的片段的GC含量很丰富，为了充分的变性，常有这种操作方法。但一般的Taq酶95度半衰期只有40分钟，所以常常采用预变性后再加酶。

作者: 假小子 时间: 2011-10-5 17:29

同意楼主的观点！偶用一般的PCR出不来
改做96度预变性10min后，加一般的taq酶进行循环，结果就出来了
目的片段1kb，偶也觉得这样做是为了更好的使模板变性！

作者: 芙蓉宫主 时间: 2011-10-5 17:30

你10分钟变性是可以，但Taq酶最好要在这一步之后加进去。

作者: pou 时间: 2011-10-5 17:31

我现在做的PCR扩增程序跟楼主差不多，先94度预变性10分钟，然后加入酶进入扩增循环。我查资料发现，用这个步骤的作用在于可以消除反应系统中可能污染的核酸酶以及蛋白酶，并且可以提高器始模板的变性效果，保存酶的活性。我用的也就是普通的酶。

作者: 按秒计算 时间: 2011-10-5 17:31

我做过一个基因，从CDNA做RT，再做PCR。2KB,分两段做。后面的一段1.6KB，很快搞定。
前面一段600bp，搞了两周，不见特异条带，只有smear。
仔细研究序列，GC含量大于80％。
用96℃变性15s，95℃变性15s，94℃变性30s，做对照实验，结果，96℃变性得到特异的阳性条带，95℃变性有比较淡的条带，94℃变性还是老样子。不过我用的是PE公司的TaqGOLD，promega的普通Taq酶96℃变性得不到条带。
后来从质粒做PCR就没有这么复杂了，正常94℃变性就能得到全长的条带。

说明RTPCR还是有难度的，质粒扩增就宽松多了。

作者: 冰激凌小姐 时间: 2011-10-5 17:35

请教啊，96度预变性的时间长短有什么影响吗？我的模板GC含量也很丰富，请问我是用96度预变性5min还是10min好呢？还能再升温吗？预变性以后是冰浴好还是直接加酶好呢？我做了两次PCR了，没有条带。我的扩增长度是1400bp。
我用的酶是Takara的Ex－taq酶。
非常感谢

作者: mogu 时间: 2011-10-5 17:35

我用小鼠的全基因组作为模板也一直没有条带出来，94度变性5分钟是不是不行啊，用95度10分钟行吗？预热后先冰浴吗，如果要冰浴的话得多久后加酶，谢了。

作者: +田田+ 时间: 2011-10-5 17:35

95C 10min，是为了将基因组中的DNA尽量的完全变性，以使为数不多的目的序列得到扩增呀，这样做有没有用呀？

我的单细胞的总DNA没有提取,就一步要求扩增出来.变性只要2min就足够了.除非你的目的片断是搞GC.
如果是这样,先不可以加酶的. 直接95度变性10min,后pause, 然后加入酶.

或加入5%DMSO来提高变性..

作者: mogu 时间: 2011-10-5 17:36

我的另外一个二次PCR 的模板只有320bp大小，用94度5分变性，梯度退火，只见smeal带，无一条带，是否与变性时间久有关系？前段时间还出过一次，后来就再没有产物了，急待回应，谢谢

作者: 8黑眼圈8 时间: 2011-10-5 17:36

应该与变性时间长短没有关系吧，如果不是退火温度的问题那么你减少模板量试试。

作者: purrr 时间: 2011-10-5 17:37

继续探讨加酶的过程，即将体系从PCR仪器拿出后加酶再放回仪器过程中对反应的影响，是不是会产生杂带？及其如何克服这一缺点？

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)