分析测试百科

标题: [分享]miRNA用荧光定量PCR检测的流程以及汇总 [打印本页]

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:02 标题: [分享]miRNA用荧光定量PCR检测的流程以及汇总

[分享]miRNA用荧光定量PCR检测的流程以及汇总 [转载]

目录如下：
一、MiRNA简介
二、反转录引物分类以及设计原理
三、引物探针设计
四、试验操作流程
1、RNA提取
2、反转录
3、荧光定量PCR
一、miRNA简介
小 RNA是 19~28nt的调控RNA分子，主要包括微 RNA(micro RNA，miRNA)和小干涉RNA(short interfering RNA，siRNA)两类，其中的miRNAs成为继 siRNAs之后新的研究热点之一，名列2002年和2003年美国《科学》杂志评出的年度十大科学成就。
miRNAs是长片段RNA序列的一部分，同siRNAs一样是比较短小的单链小分子RNA，一般来源于染色体的非编码区域，由大约70 nt大小的可形成发夹结构的前体加工而来，它通过与其目标mRNA分子的3 端非编码区域(3-untranslated region，3 UTR)互补导致该mRNA分子的翻译受到抑制。
在miRNA公共数据库miRBase (cuturl('http://www.mirbase.org/'))中已经有1W多条来自不同物种的miRNA序列。

MiRNA检测方法
要了解miRNA在基因调控中扮演的角色，很关键的一个方法就是迅速、准确地定量检测miRNA基因的表达。因此，miRNA表达水平的检测也成为了科学家们研究的热点。但是由于小分子RNA是一类很小的分子，部分小分子RNA表达水平可能很低，因而需要极为灵敏而定量的分析工具。常用的检测方法有：
1.1 Northern blotting
1.2 核糖核酸酶保护分析以及基于此方法的液相杂交。
1.3 RT-PCR也被用来检测miRNA前体的表达水平，其他基于PCR技术检测miRNA的方法有
引物延伸法，就是在引物的5 末端加一个特异标记，可以定量测定低丰度的RNA含量；
原位杂交技术（CISH,FISH）可以方便的检测miRNA的时空表达的差异。
1.4 芯片(microarrays)技术[46,47]是一种较快的研究miRNA表达的方法。

图片附件: 91455110.jpg (2011-10-6 12:03, 11.68 KB) / 该附件被下载次数 59
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8649

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:03

二、反转录引物分类以及设计原理
Real-time PCR方法克服了由于miRNA分子太短（~22 nt）带来的定量最大难题而引入靶向特异性的反转录引物，该RT引物可以与成熟miRNA结合，形成反转录引物/成熟miRNA复合物，并在miRNA的5’末端延伸。这样就得到一个较长的反转录扩增因子，为进一步做实时定量PCR提供了符合要求的摸板。
RT引物有两种类型：
1、 Oligod(T)特异的RT引物（QIAGEN产品为主）
由特异序列＋(T)20左右＋兼并碱基V或VN组成。（所有miRNA可以公用一个Oligod(T)的RT引物，但是RNA在反转录前需要进行末端Poly(A)加尾）

2、茎环状结构的RT引物（ABI产品为主）
由可以自身呈环茎状的特异序列＋6到8个miRNA3’端反向互补碱基组成。(一条miRNA序列特异对应一个茎环状结构的RT引物）

图片附件: 95787974.jpg (2011-10-6 12:04, 46.56 KB) / 该附件被下载次数 89
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8650

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:04

三、引物探针设计
由于反转录后得到的cDNA 为（miRNA+RT引物）复合片段。
上游引物可以在miRNA自身序列上找，如果GC含量太低，可以在上游引物5’端加入GCGCC等的保护碱基；下游引物在RT引物的反向互补序列中找；也就是说：上游引物是每个miRNA所特有的，下游引物为通用引物就可以了。
荧光定量PCR检测方法有SYBR Green染料法和TaqMan探针法。前者需要调整引物浓度以及引物扩增效率，把引物二聚体调整到越小越好；探针法则需要设计荧光探针，这其中由于MGB探针需要碱基数量少和特异性好的特点而被推荐（非广告）。

探针设计位置有3个：完全与miRNA序列相同、在miRNA与RT引物的交叉点、完全在RT引物上；这其中又有正向和反向互补两种情况。至于探针要设计在那个位置，根据自己试验情况而定，本人以为效果都差不多。

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:11

四、试验操作流程
1、RNA提取
在以上两种RT引物中，Ologod(T)特异引物所需要的RNA尽量是用特殊试剂盒提取的小RNA，而茎环状结构RT引物需要RNA正常提取就好。
另外由于所需样本不同RNA提取方法也不完全相同，普通组织样本和细胞可以研磨用Trizol＋氯仿抽提；血液和植物样本需要前期处理后再用Trizol＋氯仿或用专门的Kit抽提。

2、反转录
确认用Oligod(T)特异RT引物时，RNA需要进行3'Poly(A)加尾处理。
反转录的酶没有特殊要求，操作请按照各自反转录酶的说明书进行就好。这里特别注意的是：反转录过程中用到的RT引物（常规的是随机引物、Oligod(T)和特异引物）是前面提到的Ologod(T)特异引物和茎环状结构RT引物，它们分别属于Oligod(T)和特异引物范畴，在反转录中不需要另外添加其他RT引物。
在确定反转录温度中请特别注意您使用的是哪一种RT引物，而设定相应的反转录温度。

3、荧光定量PCR
优化PCR体系（引物浓度、Mg浓度、dNTP浓度、退火温度等），正常操作。

――――――――The End.――――――

作者: @花开花落@ 时间: 2011-10-6 12:13

lz您好，我用的是燃料法，上海吉玛的试剂盒。跑了两周的标准曲线，刚开始扩增效率一直只有74%，非特异性扩增也比较多，今天把循环条件改成了三步法后，非特异性扩增只有一个孔有，但扩增效率却增高到118%,这个是引物的问题吗？结果没有偏离很大的数据。还有，我的阴性对照组，经常扩增曲线，我昨天把所有的试剂都换用了新的了，操作也很注意预防污染，比如换工作区操作，擦洗工作台等，加样时也是先加的阴性对照，标准曲线的加样先后按浓度从低到高孔的顺序加的，最好加cDNA，我这些是怎么回事呢？我怀疑是我的引物设计的不好。麻烦楼主帮忙分析下吧，谢谢！

作者: @花开花落@ 时间: 2011-10-6 12:13

我觉得是我的引物没有设计好，所以可能有二聚体的形成，导致阴性对照有扩增曲线和高扩增效率，请大家帮忙分析下，嘿嘿。

作者: 131415 时间: 2011-10-6 12:14

lz 如果用looped rt引物，反转录时，应不应该有 rna和引物混合加热再退火这一步骤。常规rtprotocol里都有这一步。不过如果反转录mirna时这样会不会使looped引物不能很好区分pre-mirna和成熟rna，因为变性后loop的位阻效应就没了。

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:15

lz 如果用looped rt引物，反转录时，应不应该有 rna和引物混合加热再退火这一步骤。常规rtprotocol里都有这一步。不过如果反转录mirna时这样会不会使looped引物不能很好区分pre-mirna和成熟rna，因为变性后loop的位阻效应就没了。

===========================================================================

我只是按照反转录酶（如Superscript 2）的相关特异引物的操作说明操作，开始是有65度加热的步骤。
您说的情况我没仔细想过，只是PCR产物3％胶的电泳条带来看还比较单一，应该没事。

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:17

lz您好，我用的是燃料法，上海吉玛的试剂盒。跑了两周的标准曲线，刚开始扩增效率一直只有74%，非特异性扩增也比较多，今天把循环条件改成了三步法后，非特异性扩增只有一个孔有，但扩增效率却增高到118%,这个是引物的问题吗？结果没有偏离很大的数据。还有，我的阴性对照组，经常扩增曲线，我昨天把所有的试剂都换用了新的了，操作也很注意预防污染，比如换工作区操作，擦洗工作台等，加样时也是先加的阴性对照，标准曲线的加样先后按浓度从低到高孔的顺序加的，最好加cDNA，我这些是怎么回事呢？我怀疑是我的引物设计的不好。麻烦楼主帮忙分析下吧，谢谢！

=============================================================================================================

我在设计U5基因和5s引物的时候也遇到这种情况，后来吧引物换了几条。我想您可以多设计几条引物看看。而且如果您用染料法的话，引物非特异扩增一定要降到最低。

作者: 98776langtao 时间: 2011-10-6 12:18

请教lz个问题，你用过+a尾，用t引物反转录的方法么。现在我用的特异性rt引物，每测一个mirna就得反转录一次，又麻烦又费钱。不知道+a尾的方法与特异性反转的方法相比特异性怎么样。lz有没有介绍这种方法的文献资料之类的？？

作者: 年轮 时间: 2011-10-6 12:19

PCR新手，也要做miRNA的实验，请楼主或其他的高人指导一下：
①为什么用stem-loop的方法反转录，需要测定一个miRNA就反转录一次？不能一次把要测的几个miRNA的stem-loop引物都加进去？
②为什么用poly(A)的方法要比用stem-loop节省RNA？
②用poly(A)的方法反转录，之后qPCR时，一次能检测几个miRNA？
问题比较傻，刚开始学。谢谢大家了！

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:20

PCR新手，也要做miRNA的实验，请楼主或其他的高人指导一下：
①为什么用stem-loop的方法反转录，需要测定一个miRNA就反转录一次？不能一次把要测的几个miRNA的stem-loop引物都加进去？
②为什么用poly(A)的方法要比用stem-loop节省RNA？
②用poly(A)的方法反转录，之后qPCR时，一次能检测几个miRNA？
问题比较傻，刚开始学。谢谢大家了！

==============================================================================================

1、如果你想一次反转录就得到所要的RNA，你可以吧几个loop引物放在一起，只是我没试验过，不知道分开好还是放一起好。
2、poly(A)的方法不比用stem-loop节省RNA，相反他需要更多的RNA。
3、如果用OligodT的反转录引物，你能检测你想要的miRNA，但是在反转录过程中，Oligodt的特异性要差一些。

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:20

再请教lz个问题，你用过+a尾，用t引物反转录的方法么。现在我用的特异性rt引物，每测一个mirna就得反转录一次，又麻烦又费钱。不知道+a尾的方法与特异性反转的方法相比特异性怎么样。lz有没有介绍这种方法的文献资料之类的？？

================================================================================================================

OligodT方法反转录我尝试过，但是由于在反转录前需要PolyA加尾，RNA需要的量比较多，后来就放弃了（我从血液里提取RNA，得量不高）。关于灵敏度我可以告诉你同样的量的RNA用Loop反转录引物会灵敏度大得多。特异性来说，OligodT的反转录引物比特异引物特异性要低一些，但是PolyA的OligodT方法一样能得到特异的PCR产物。相对来说增加PolyA一步骤的成本同反转录相比应该差不多（没仔细算过）
你可以尝试下两种方法：1、把多个你想检测的特异引物放在一起进行反转录（引物之间有没有干扰等影响我没尝试过）；2、用OligdT引物进行反转录（如果你有比较多的RNA，）。

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:21

可能出现的一些问题（1）
也许用RNA Poly(A)加尾后进行PCR会出现PCR产物没有目的条带的情况，
希望在做目的基因时同时做下内参基因（U6或者5srRNA或者其他），如果内参基因也没有出现条带，说明RNA本身或者在反转录前RNA消耗掉了，或者反转录过程中出现问题没有得到理想的cDNA；如果内参有条带或有曲线，就从目的基因引物开始分析。

作者: caihong 时间: 2011-10-6 12:21

请教lz一个问题：用stem-loop的方法反转录microRNA后，qPCR可以用SYBR Green染料法吗？看文献上都是用探针法，我用了燃料法没有做出来，不知道这样做可不可行？新手上路，请多多指教！

作者: 蛐蛐儿 时间: 2011-10-6 12:22

lz，你好，我想请教你：颈环法的那个颈环序列是什么？是通用的吗？O(∩_∩)O谢谢

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:22

一般用颈环结构的RT引物，RNA在反转录的时候用量按正常反转录的量即可’如果使用像AB等公司的成品RT引物和RealTime PCR引物探针套装，而PCR曲线以及电泳条带不是很好，则需要考虑PCR模板的问题，是不是RNA量太低？？或者反转录效果不好？？？
如果使用的是自己设计的RT引物，则我建议选择用AB等公司的成品作为阳性对照，这样在实验过程中可以少走很多弯路。

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:24

请教lz一个问题：用stem-loop的方法反转录microRNA后，qPCR可以用SYBR Green染料法吗？看文献上都是用探针法，我用了燃料法没有做出来，不知道这样做可不可行？新手上路，请多多指教！

================================================================================================================

其实用什么方法都可以的。我一般是先用染料法验证RT引物和PCR引物怎样，然后再设计探针的。
如果你用染料发做不出来，原因你应该找一找，我想这跟用探针或者染料没什么关系。PCR产物跑过琼脂糖凝胶电泳没？？目的条带怎样？我想您可以这样试下：1、先用普通PCR跑电泳看看有没有条带，条带好不好？不好就需要找原因、优化 2、条带好的话，然后用染料法做，这样保证PCR体系本身没什么问题 3、如果你觉得探针法特异性更好（事实确实如此），在以上条件的情况下可以设计探针了

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:25

lz，你好，我想请教你：颈环法的那个颈环序列是什么？是通用的吗？O(∩_∩)O谢谢

=======================================================================================

您好，您可以找找楼上我提供的两篇文章，分别是关于以上两种RT引物的序列的。也许可以给您一些建议和帮助。

作者: 碧空子 时间: 2011-10-6 12:26

想和你讨论几个问题
1.你在前面的帖子说，加A法比茎环的方法耗费的RNA量更多？但在反转录体系中加入的RNA量增大是可以提高检测灵敏度的，也就是说虽然加入了更多量的RNA，但实验的灵敏度得到了提高，所以不能直接说加A法比茎环法消耗的RNA量更多的。
2.对于茎环法的特异性，因为现在准备开展这方面的实验，也在这两种方法中犹豫。LZ现在的实验数据能够证明茎环法反转录的特异性比加尾法的高吗？虽然按照原理来说，在反转录阶段茎环法有反转的特异性而加A法没有，但我听说茎环法由于引物存在茎环结构，具有空间位阻的情况，因此转录效率比加A法低。
3.茎环法的引物如果购买的话，大概多少米啊？

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:28

想和你讨论几个问题
1.你在前面的帖子说，加A法比茎环的方法耗费的RNA量更多？但在反转录体系中加入的RNA量增大是可以提高检测灵敏度的，也就是说虽然加入了更多量的RNA，但实验的灵敏度得到了提高，所以不能直接说加A法比茎环法消耗的RNA量更多的。
2.对于茎环法的特异性，因为现在准备开展这方面的实验，也在这两种方法中犹豫。LZ现在的实验数据能够证明茎环法反转录的特异性比加尾法的高吗？虽然按照原理来说，在反转录阶段茎环法有反转的特异性而加A法没有，但我听说茎环法由于引物存在茎环结

作者: 8黑眼圈8 时间: 2011-10-6 12:28

你做过两种方法的对比实验？那太好了。你的实验结果是说茎环法的灵敏度要高十倍左右？
如果自己合成茎环引物，有没有什么规则可以参考的？

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:29

你可以看下我上面提供的其中一篇文章，上面有RT引物的序列，另外为了保证试验的顺利进行，我建议你还是购买一道两个公司的引物做为阳性对照，这样可以确保你能尽快判断设计的RT的引物是否够好，一般我觉的只要与公司的产品CT值相差不大（1个CT左右）就可以了。当然，如果你的经费充足，时间由宝贵，大可以购买公司产品，ABI公司的很贵，但是效果够好（非广告）。

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:30

如果大家的样本两位比较少又很宝贵（例如血清），我建议用比较好的RNA提取试剂盒来进行RNA的提取（QIAGEN公司的还不错，非广告），这样避免因为RNA没提好而浪费样本的情况发生。
另外因为样本量比较少，RNA用琼脂糖凝胶电泳来分析RNA的完整性可能就行不通了，在这里建议的是或者直接测个OD就算了（电泳就是跑了也看不清条带），或者有条件的可以用一种微量测RNA OD的仪器，它可以给出RNA的峰图，效果还不错哦（可惜lz龄大健忘，忘记国外哪个公司的产品了。）
对于荧光定量PCR试验的一个重要问题就是：内参基因一定要选好，如果没有合适的，干脆去公司买一份U6的内参基因，这样既能保证您的内参基因完美、又能同时验证您的试验到底怎么样。

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:31

其实出现问题大家讨论的话会解决很快，LZ不是万能的，他可能什么都不懂。我建立这个平台的目的就是希望大家能把关于miRNA的试验出现的问题汇总一下，大家来这里多讨论讨论。

我的格言：没有交流，没有进步

作者: =菓子= 时间: 2011-10-6 12:31

如果SYBR染料实时PCR检测疾病组和对照组miRNA的差异，U6做对照，怎么摸条件啊。进行实时PCR前我用普通逆转录PCR跑胶，U6的亮度不一样。是不是每个样品中U6的量要统一？即：将U6的模板量统一。新手，请各位赐教！

作者: 白白的 时间: 2011-10-6 12:32

如果大家的样本两位比较少又很宝贵（例如血清），我建议用比较好的RNA提取试剂盒来进行RNA的提取（QIAGEN公司的还不错，非广告），这样避免因为RNA没提好而浪费样本的情况发生。
另外因为样本量比较少，RNA用琼脂糖凝胶电泳来分析RNA的完整性可能就行不通了，在这里建议的是或者直接测个OD就算了（电泳就是跑了也看不清条带），或者有条件的可以用一种微量测RNA OD的仪器，它可以给出RNA的峰图，效果还不错哦（可惜lz龄大健忘，忘记国外哪个公司的产品了。）
对于荧光定量PCR试验的一个重要问题就是：内参基因一定要选好，如果没有合适的，干脆去公司买一份U6的内参基因，这样既能保证您的内参基因完美、又能同时验证您的试验到底怎么样。

==========================================================================================

测OD也不准吧？血清中量很少的，OD值很低，仪器的偏差会影响到测定值的。微量的仪器是Thremo的Nanodrop吧。
如果买内参的话，是需要从提取时就要加入到血清中的吧，没有这样做过，呵呵！

作者: 白白的 时间: 2011-10-6 12:32

如果SYBR染料实时PCR检测疾病组和对照组miRNA的差异，U6做对照，怎么摸条件啊。进行实时PCR前我用普通逆转录PCR跑胶，U6的亮度不一样。是不是每个样品中U6的量要统一？即：将U6的模板量统一。新手，请各位赐教！

==============================================================================================

U6做为对照的话，不需要调整的吧？只要保证U6基因的表达量不变就可以了。最后用U6的表达量做为均一化的标准即可。

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:33

如果SYBR染料实时PCR检测疾病组和对照组miRNA的差异，U6做对照，怎么摸条件啊。进行实时PCR前我用普通逆转录PCR跑胶，U6的亮度不一样。是不是每个样品中U6的量要统一？即：将U6的模板量统一。新手，请各位赐教！

================================================================================================================

不用要求U6的量要一致阿，因为每个样本的目的基因是跟内参相比较的一个相对量（△△CT或便标准曲线）来进行比较。但是样本之间的U6的量比较能说明样本初始模板的量多少问题，具体比较的数据还是遵循以上的比较比较好。

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:34

测OD也不准吧？血清中量很少的，OD值很低，仪器的偏差会影响到测定值的。微量的仪器是Thremo的Nanodrop吧。
如果买内参的话，是需要从提取时就要加入到血清中的吧，没有这样做过，呵呵！

===============================================================================================================

Thremo的应该还是蛮准的。另外，U6 内参基因是用在PCR中的，我不知道楼上你说提取时就加进去作用是什么？
U6的内参基因是在荧光定量PCR中作为一个对照来对待的，每个基因的CT和内参的CT比较后用（△△CT）来得出相对比较值是相对定量的一种比较常规的计算方法，不知道你是不是有打算用此法还是直接做标准曲线来绝对定量。

作者: =菓子= 时间: 2011-10-6 12:35

其实用什么方法都可以的。我一般是先用染料法验证RT引物和PCR引物怎样，然后再设计探针的。
如果你用染料发做不出来，原因你应该找一找，我想这跟用探针或者染料没什么关系。PCR产物跑过琼脂糖凝胶电泳没？？目的条带怎样？我想您可以这样试下：1、先用普通PCR跑电泳看看有没有条带，条带好不好？不好就需要找原因、优化 2、条带好的话，然后用染料法做，这样保证PCR体系本身没什么问题 3、如果你觉得探针法特异性更好（事实确实如此），在以上条件的情况下可以设计探针了

==============================================================================================================

非常谢谢lz的建议！
你所说的“普通PCR”是指什么？非microRNA，某基因的mRNA翻转录产物PCR？microRN***段小，其PCR产物在琼脂糖凝胶上可以看到条带吗？

作者: 8黑眼圈8 时间: 2011-10-6 12:35

我看过很多帖子和文献，设计了一个STEM-LOOP引物，希望大家给个意见。
GTCGTATCCAGTGC AGGGTCCGAGGTATT CGCACTGGATACGAC TCAACA

GTCGTATCCAGTGC和CGCACTGGATACGAC是互补成茎的，AGGGTCCGAGGTATT就是环，TCAACA是我做的miRNA的3端互补。

虽然设计出来了，但是就是不知道回来如何处理成环，希望大家能给点意见。看文献没有找到，之前咨询过说通过60,95退火，但是不知道时间是多少

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:36

我看过很多帖子和文献，设计了一个STEM-LOOP引物，希望大家给个意见。
GTCGTATCCAGTGC AGGGTCCGAGGTATT CGCACTGGATACGAC TCAACA

GTCGTATCCAGTGC和CGCACTGGATACGAC是互补成茎的，AGGGTCCGAGGTATT就是环，TCAACA是我做的miRNA的3端互补。

虽然设计出来了，但是就是不知道回来如何处理成环，希望大家能给点意见。看文献没有找到，之前咨询过说通过60,95退火，但是不知道时间是多少

============================================================================================================

楼上是直接合成还是以上序列分开合成的?如果是这些序列连在一起合成的,你就不用担心环状问题,拿来稀释成5uM的直接用就可以哦.不用担心它成不成环状问题.例如就是按照Invitrogen的Supper Script 2的说明书，首先RT引物和RNA在65度变性下（大概可以成环了），其他按照说明书操作就好。

作者: tianmei001 时间: 2011-10-6 12:36

楼主首先感谢你分享这么多有用的东西
目前我遇到这样一个情况
realtime PCR过程中
我的U6效果一直很差荧光值上不去
如果您愿意又方便能否请您上传一套您使用效果很好的U6 RT (STEMLOOPPRIMER) 以及forward and reverse primer
非常感谢

作者: #甜# 时间: 2011-10-6 12:37

分享一下我的实验经历，同时希望各位给点建议哦。
我做血清microRNA表达分析，目前用的内参为U6.用100ul血浆提取的总RNA(Ambion 1556试剂盒），荧光定量试剂盒为ABI公司的探针法。RT 为15ul,PCR体系为5ul(384孔板）。结果是样本中U6的CT值都很高，平均32以上，不知能用吗？想提高点有什么办法吗？
另外，我还测了总RNA的OD,浓度大的有20ng/ul,小的也有4ng/ul.

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:38

楼主首先感谢你分享这么多有用的东西
目前我遇到这样一个情况
realtime PCR过程中
我的U6效果一直很差荧光值上不去
如果您愿意又方便能否请您上传一套您使用效果很好的U6 RT (STEMLOOPPRIMER) 以及forward and reverse primer
非常感谢

================================================================================================================

你好，我的U6是用的ABI的产品，由于自己设计的一直没有办法跟AB的产品有能力比较，加上经费紧张，就放弃了。我原来的考虑U6 CT值靠后的原因是RT引物后面的U6基因的锚定碱基太少了（我用的最多是8个碱基），也许再多几个应该就可以了（12－14个）因为你也知道，U6的序列比较长大约200bp左右，所以多加几个锚定碱基应该对序列本身没有多大影响。

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:38

分享一下我的实验经历，同时希望各位给点建议哦。
我做血清microRNA表达分析，目前用的内参为U6.用100ul血浆提取的总RNA(Ambion 1556试剂盒），荧光定量试剂盒为ABI公司的探针法。RT 为15ul,PCR体系为5ul(384孔板）。结果是样本中U6的CT值都很高，平均32以上，不知能用吗？想提高点有什么办法吗？
另外，我还测了总RNA的OD,浓度大的有20ng/ul,小的也有4ng/ul.

===============================================================================================================

如果全部用AB的产品，U6还那么靠后的话应该是血浆中RNA实在是很少。那么请问您反转录的时候RNA加多少？？我的建议是：把反转录体系里的水都换成RNA，这样也许会得到较多量的cDNA.
如果U6的内参引物（RT和PCR）探针是您自己设计，那么需要您用全血或者组织里提取的RNA反转录的cDNA做模板进行比较下，看看是不是由于U6本身的RT引物、PCR引物等的原因

作者: 小鱼鱼 时间: 2011-10-6 12:39

不知楼主对miRNA内参了解多少
能不能给详细介绍一下，尤其是u6和u6B，至今还迷糊着呢~

作者: 猫屎一号 时间: 2011-10-6 12:39

请楼主回答我的问题 1.我是新手，全血miRNA前期怎么处理后？然后才能用trizl和氯仿
2.全血miRNA好提取吗？我担心啊提不出来。

作者: SOS 时间: 2011-10-6 12:40

如果全部用AB的产品，U6还那么靠后的话应该是血浆中RNA实在是很少。那么请问您反转录的时候RNA加多少？？我的建议是：把反转录体系里的水都换成RNA，这样也许会得到较多量的cDNA.
如果U6的内参引物（RT和PCR）探针是您自己设计，那么需要您用全血或者组织里提取的RNA反转录的cDNA做模板进行比较下，看看是不是由于U6本身的RT引物、PCR引物等的原因

===================================================

恩，一方面我想提高血浆量，二是按你说的，反转录多加总RNA.
U6的引物探针都是ABI的。

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:40

请楼主回答我的问题 1.我是新手，全血miRNA前期怎么处理后？然后才能用trizl和氯仿
2.全血miRNA好提取吗？我担心啊提不出来。

=============================================================================================================

您好，全血提取miRNA我是用的QIagen的全血RNA提取试剂盒加上他的EL Buffer，前期处理是拿1ml的全血（少了没试过）用ELBuffer进行溶解红细胞，离心后在进行Trizol的提取（试剂盒的Qiazol其实是一样的），这样提取出来的RNA ，取5ul进行特异RT引物的反转录后进行PCR的CT值在13到16之间。

另外，QIAGEN的ELbuffer我不知道配方，所以暂时我建议你可以单独购买QIAGEN的EL Buffer，处理后，然后用Tizol常规提取。

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:41

非常谢谢lz的建议！
你所说的“普通PCR”是指什么？非microRNA，某基因的mRNA翻转录产物PCR？microRN***段小，其PCR产物在琼脂糖凝胶上可以看到条带吗？

==============================================================================================

我的PCR产物40到110的条带不等，但是用3％的琼脂糖凝胶跑电泳时间长一点还是能看出来的，（二聚体全都弥散掉了）

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:41

不知楼主对miRNA内参了解多少
能不能给详细介绍一下，尤其是u6和u6B，至今还迷糊着呢~

==============================================================================================================

miRNA的内参我觉得个人喜好，拿U6来说,miRNA的数据库和AB（AB的有600多bp的，到那时前面120bp左右与它们的序列一样）的数据库都是两条（应该是U6B和U6），序列同NCBI上的U6一样。这两条基因一个50bp左右，一个120bp左右，我是用的120bp左右的序列设计的引物（这个内参比较郁闷，建议在设计RT引物的时候U6的锚定碱基加长到12bp左右），染料法CT值13，探针法CT值14－15（AB的U6引物探针用相同的模板CT值14－15）.
另外有个内参5sRNA，我从老鼠那里得来的，具验证人的一样用，这个内参比较容易出来，锚定碱基6个就够了。

作者: @木木@ 时间: 2011-10-6 12:42

您好，全血提取miRNA我是用的QIagen的全血RNA提取试剂盒加上他的EL Buffer，前期处理是拿1ml的全血（少了没试过）用ELBuffer进行溶解红细胞，离心后在进行Trizol的提取（试剂盒的Qiazol其实是一样的），这样提取出来的RNA ，取5ul进行特异RT引物的反转录后进行PCR的CT值在13到16之间。

另外，QIAGEN的ELbuffer我不知道配方，所以暂时我建议你可以单独购买QIAGEN的EL Buffer，处理后，然后用Tizol常规提取。

================================================================================================================

尊敬的楼主先生，我主要想知道：1，因为组织标本，我们可以保存在液氮中，全血标本前期的处理在网上我找不到，我最关心的是处理后怎么保存，能保存多长时间，因为我们的实验室离得有点远。2，还有，我想知道怎么去测量一个miRNA cDNA和内参基因PCR时的扩增率，3，由于我刚刚学习实验，最后那个CT值测出来的是（CT目标-CT内参）还是分别可以测出来（这问题可能有点傻里傻气的）4，我想问一下楼主是否了解REST软件希望楼主能尽可能的回答我的问题，我会经常光顾楼主的帖子的！谢谢！

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:42

尊敬的楼主先生，我主要想知道：1，因为组织标本，我们可以保存在液氮中，全血标本前期的处理在网上我找不到，我最关心的是处理后怎么保存，能保存多长时间，因为我们的实验室离得有点远。2，还有，我想知道怎么去测量一个miRNA cDNA和内参基因PCR时的扩增率，3，由于我刚刚学习实验，最后那个CT值测出来的是（CT目标-CT内参）还是分别可以测出来（这问题可能有点傻里傻气的）4，我想问一下楼主是否了解REST软件希望楼主能尽可能的回答我的问题，我会经常光顾楼主的帖子的！谢谢！

==============================================================================================================

呵呵虾客气。
我也是做了没多久，大家讨论下好了：1：（待抗凝剂的）血液可以放在液氮（要封闭好哦）或者干冰运输，这样可以保存比较长的时间（我的先用干冰后放在－80度冰箱，保存半年还能用）。2：一个引物和探针的扩增效率可以用稀释的模板来做类似标准曲线的方式计算得出，有相关的计算公式您不妨查一下；3、每个基因的CT值就是这个基因的CT值，如果您想要
△CT需要您计算得出（CT目标-CT内参）;4、最后很遗憾，看样子我要多学习下才行，我去网站搜搜，看看是什么样的软件，如果您熟悉，可以帮我等扫扫盲。希望能解答您的问题。嘿嘿

ps：REST软件是不是网络的那个，还真不知道呢，没用过，不知道怎么用，咱只用过HTTP。

作者: 魔法师A 时间: 2011-10-6 12:43

1，你那个血液用的是SYBR Green Ⅰ染料荧光分析的茎环Realtime RT-PCR还是Taqman探针，我用前者，不知道能不能做出来
2，我真的找不到扩增率的计算公式，如果有什么软件可以计算的话就更好了，楼主那如果有的话我一个公式，跪谢！

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:43

1，你那个血液用的是SYBR Green Ⅰ染料荧光分析的茎环Realtime RT-PCR还是Taqman探针，我用前者，不知道能不能做出来
2，我真的找不到扩增率的计算公式，如果有什么软件可以计算的话就更好了，楼主那如果有的话我一个公式，跪谢！

===============================================================================================================

你好，因为节省成本，我是先用Srby Green做CT曲线，然后跑电泳，如果效果都很好，才开始合成探针，相对来说CT值相差不多。但是用染料法需要把引物的浓度降到最低（梯度稀释）以避免引物二聚体带来的荧光干扰；
2、引物的扩增效率公式：扩增效率E%=[10^1/|K|-1]*100%，其中K为标准曲线斜率

作者: 麻瓜 时间: 2011-10-6 12:43

楼主真乃神人啊，我很很羡慕你啊，我也真的好好想把自己的实验做出来，但有时我真的对自己没什么信心啊，做血液我都有种想放弃的冲动

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:44

楼主真乃神人啊，我很很羡慕你啊，我也真的好好想把自己的实验做出来，但有时我真的对自己没什么信心啊，做血液我都有种想放弃的冲动

================================================================================================================

呵呵,其实miRNA很难降解的，室温存放好几个月的石蜡切片的miRNA我都提取过，内参CT在20以内，所以根本不用担心。只是血液里的RNA真的难提取，需要在不降解RNA的情况下破坏红细胞，才能对白细胞下手。

作者: 明天的明天 时间: 2011-10-6 12:44

我现在在做血浆中的miRNA 的表达，提的浓度很低。有时分光光度计都是负值。但是用QIAGEN的反转录和SYBR GREEN pcr的盒子有几个目的基因还不错，也有的熔解曲线不太理想。所以需要把PCR的产物跑胶分析一下，有无引物二聚体等等。请问楼主PCR怎样跑胶检测？在园子里没找到相关的文章比如胶的配置方法啊以前跑的rt-pcr的产物放在-20度冰箱里的能不能用来跑胶？是不是要用新鲜的标本？

作者: 明天的明天 时间: 2011-10-6 12:45

还有一个问题想请教楼主 miRNA的反转录及PCR产物是不是用聚丙烯酰胺电泳比琼脂糖效果要好考虑到分子量大小的问题

作者: 爬呀爬 时间: 2011-10-6 12:45

弱弱的问一下各位，用SYBR Green染料法时内参基因是加在目的基因同一反应管中还是与目的基因分两管？

作者: 蝴蝶结子 时间: 2011-10-6 12:45

LZ,你好！
我做的小鼠腹膜的MicroRNA实验。为什么我提取的组织RNA的RT-PCR数据分析时CT值误差很大，而且Tm值那一栏没有数值，一个都没有。9个样本，做出来却只有3根溶解曲线。会不会是没有提取到RNA?怎么验证？
请帮忙解答，谢谢！

作者: 糊涂虫 时间: 2011-10-6 12:46

谢谢呦，很有用呀，只是pcr有太多不懂了

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:46

我现在在做血浆中的miRNA 的表达，提的浓度很低。有时分光光度计都是负值。但是用QIAGEN的反转录和SYBR GREEN pcr的盒子有几个目的基因还不错，也有的熔解曲线不太理想。所以需要把PCR的产物跑胶分析一下，有无引物二聚体等等。请问楼主PCR怎样跑胶检测？在园子里没找到相关的文章比如胶的配置方法啊以前跑的rt-pcr的产物放在-20度冰箱里的能不能用来跑胶？是不是要用新鲜的标本？

==============================================================================================================

您好，由于本人原因近来很少来论坛，没有即使给答复不好意思。
关于血液里RNA的量底，不知道您用多少血浆来提取？我用8ml全血最后提取得来的RNA DO值都不一定很高，何况血浆。我想可以这样：提取RNA的试剂盒一定要好、反转录时候把体系的水全部换成RNA，看看每个样本的内参怎样以确定RNA到底低到如何让程度。

关于您的问题，我是这样做的：普通的琼脂糖凝胶，浓度3％，单排梳子长一些（这杨跑的时间长也不会跑出去），时间30－45min，DNAmaker用小的，100bp可以用

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:47

还有一个问题想请教楼主 miRNA的反转录及PCR产物是不是用聚丙烯酰胺电泳比琼脂糖效果要好考虑到分子量大小的问题

====================================

是的，不过我没跑过，可能需要您亲自摸索下

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:47

弱弱的问一下各位，用SYBR Green染料法时内参基因是加在目的基因同一反应管中还是与目的基因分两管？

==================================================================

哦，这个啊，加在同一管中我还没做过，不知道比起后者效果怎样。兄弟你可以试一下

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:47

LZ,你好！
我做的小鼠腹膜的MicroRNA实验。为什么我提取的组织RNA的RT-PCR数据分析时CT值误差很大，而且Tm值那一栏没有数值，一个都没有。9个样本，做出来却只有3根溶解曲线。会不会是没有提取到RNA?怎么验证？
请帮忙解答，谢谢！

===============================================================================================================

您好，关于这个问题，可能需要您多个方面去验证：1、RNA的OD值怎样？反转录时您可以把体系里的水都弄成RNA，也许会好些；2、内参基因CT值多少？每个样本的内参CT如果都靠后或者没有的话应该是RNA不够；3、如果内参CT好的话，把你定量完的PCR产物跑3％的凝胶电泳看下有没有条带，如果没有，看看是否目的基因的引物有问题？

作者: 如影随形 时间: 2011-10-6 12:48

推荐miRNA检测的一种Taqman 水解探针法。
作者采用了罗氏的探针，特异性比不上ABI的，但是成本和sybgreen的价格差不多，效果要比sybgreen好很多。

目前市场上面 ABI的Taqman miRNA 是miRNA 检测的金标准。

另外常用的还有基于 stem-loop的（stem loop 是ABI的专利，所以正规的大公司都不会有Stem loop的试剂盒）
1. Sybgreen方法（客户群最多，但是效果不稳定）
2. 自行设计的Taqman方法（由于合成的探针是国内的普通探针大概20多个bp比ABI的MGB探针至少要多出6个bp，再加上引物常常会把miRNA挤的很满）

基于加尾方法的
1. Qiagen公司的试剂
2. Exiqon公司的试剂采用了锁核酸技术同时有人的全miRNA基因表达芯片产品

作者: 饭团团 时间: 2011-10-6 12:48

楼主啊楼主我请教你我什么我的PCR结果曲线高度不够，而且电泳没跑出来是怎么回事啊，大哥请指教

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:49

楼主啊楼主我请教你我的PCR结果曲线高度不够，而且电泳没跑出来是怎么回事啊，大哥请指教

================================================================================================================
关于您的问题，其实曲线高度不够只是荧光信号问题，跟PCR产物有和无关系应该不大，因为没有图，不能看看您的曲线是什么样子。还有不知道您的实验又没有NTC？有的话NTC有没有曲线？还有就是电泳的二聚体亮不亮？多大的胶？
实验如果不出东西就一项一项排除，最后您的就一定能得到结果（我的方法，可能比较笨点，我觉得还十分管用）

作者: applebook=213 时间: 2011-10-6 12:49

你好，我想利用外周血直接做PCR，您在帖子里提到的血液和植物样本需要前期处理后再用Trizol＋氯仿或用专门的Kit抽提。能具体说说吗，或者我应该上哪里找相关资料呢？谢谢

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:50

你好，我想利用外周血直接做PCR，您在帖子里提到的血液和植物样本需要前期处理后再用Trizol＋氯仿或用专门的Kit抽提。能具体说说吗，或者我应该上哪里找相关资料呢？谢谢

==============================================================================================================

你好，全血的话需要去除红细胞，一般使用5-7倍体积的Qiagen的EL Buffer（其成分本人没有研究过，并不了解，我想用RNAse Free的水也许可以）稀释全血，一般冰上放置10min的样子，具体的您可以在网上找下Qiagen的RNA提取KIT的说明书；

至于植物您也知道植物需要去除过多的多糖、等等物质，所以需要前处理（所用溶液许多公司有卖tiangen、TAKARA都有）。

作者: 眼药水~ 时间: 2011-10-6 12:50

楼主你好，我做4种组织中的microRNA，PCR曲线出来了，不知道正不正确，让你参考一下，电泳没出来（别人说是引物二聚体），不知道什么原因，我给你看一下总的情况，麻烦楼主看一下我整体的情况，给予指正：
1，茎环引物设计，我是按以下条件设计的，楼主看看有没有问题：microRNA的引物设计
以hsa-miR-145为例设计引物，其成熟体序列为：GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU
反向引物：每个反向引物的都带有一段固定的序列，可以形成一个茎环，
固定的序列为：5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3，
TGGTGTCGTGGAGTCG
在这个序列后加上八个碱基，这八个碱基是hsa-miR-145从后面数八个碱基的反向互补序列，就是GAAUCCCU的反向互补：AGGGATTC，最后得到的反向引物的序列为
5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG AGGGATTC -3，
正向引物：每个正向引物也带有一段固定的序列，固定的序列为：ACACTCCAGCTGGG
在这个序列后加上于成熟体除后面六个外剩下的碱基序列，成熟体除掉后面六个碱基后序列为：GUCCAGUUUUCCCAGGA，把U变成T即可，最后的序列为：
5，-ACACTCCAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGA -3，
URP：统一反向引物，也是一段固定的序列，TGGTGTCGTGGAGTCG
U6引物F-CTCGCTTCGGCAGCACA ，R-AACGCTTCACGAATTTGCGT

作者: 眼药水~ 时间: 2011-10-6 12:50

2.RT的反应体系及其反应条件：
反应体系(25ul)：总RNA逆转录 2ul
茎环RT引物 2ul
RNase inhibitor 1ul
MLV-逆转录酶 1ul
dNTP 1ul
buffer 5UL
水 13ul
反应条件为：25度 10min,42度 60min,52度15min，70度15min,反应结束后-20度保存（我一般是-80度保存）

作者: 眼药水~ 时间: 2011-10-6 12:51

3.SYBR green 反应体系及其反应条件：
反应体系（25ul有两种）：
5乘R-PCR Buffer 5ul(5ul)
无Mg2+(因为Buffer里有) 0
10mM dNTP 0.75ul(1ul)
10uM 上游引物 0.5ul (1ul)
10uM 下游引物 0.5UL (1ul)
25乘SYBR green 1.0ul (1ul)
ROX 1ul (1ul)
DNA聚合酶 0.25ul（0.5ul）
dd水 14.7ul(12.5ul)
模板（CDNA） 1.0u
反应条件：95度变性10min 95度15sec ,60度 1min (40个循环)

作者: 眼药水~ 时间: 2011-10-6 12:51

4。PCR的结果1（附图）

图片附件: 67758859_snap.jpg (2011-10-6 12:52, 37.14 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8651

作者: 眼药水~ 时间: 2011-10-6 12:52

PCR结果2

图片附件: 27171024_snap.jpg (2011-10-6 12:52, 32.18 KB) / 该附件被下载次数 32
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8652

作者: 眼药水~ 时间: 2011-10-6 12:52

PCR结果3

图片附件: 11058674_snap.jpg (2011-10-6 12:53, 41.49 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8653

作者: 眼药水~ 时间: 2011-10-6 12:53

miRNA PCR荧光值基本上在哪个范围？是不是在0-1之间？？？？？请楼主给我的指导

作者: 我佛慈悲 时间: 2011-10-6 12:53

楼上的，你说的是不是阈值和基线？

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:54

正向引物：序列5，-ACACTCCAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGA -3，
URP：统一反向引物，也是一段固定的序列，TGGTGTCGTGGAGTCG
U6引物F-CTCGCTTCGGCAGCACA ，R-AACGCTTCACGAATTTGCGT

==============================================================================================================

你好，由于您的图片看不到，只能就您的引物来分析下：就您的正向引物来讲，这个引物的TM值高达76度，而反向引物TM值只有51度。从这里分析：这对引物由于TM相差实在太多，（Primer Express3的参数）我以前做的是在正向引物的5‘端加几个类似保护碱基就够了，没有像您那样加的那么多，而且在引物设计时，最好能引物设计和本身序列两方面都考虑下，找个折中的引物序列。而且检测基因的引物跟您的U6引物的TM值最好相近（毕竟您要他们在一个PCR仪里面同时工作）。
PCR产物没有的话应该没扩增。如果您的实验有CT值的话，请问做没做NTC？NTC有没有CT值？
希望对你有用。

作者: blueeye 时间: 2011-10-6 12:54

你说的是不是阈值和基线？

===================

不是，是荧光积累高度

作者: 胖小妮子 时间: 2011-10-6 12:55

你好，由于您的图片看不到，只能就您的引物来分析下：就您的正向引物来讲，这个引物的TM值高达76度，而反向引物TM值只有51度。从这里分析：这对引物由于TM相差实在太多，（Primer Express3的参数）我以前做的是在正向引物的5‘端加几个类似保护碱基就够了，没有像您那样加的那么多，而且在引物设计时，最好能引物设计和本身序列两方面都考虑下，找个折中的引物序列。而且检测基因的引物跟您的U6引物的TM值最好相近（毕竟您要他们在一个PCR仪里面同时工作）。
PCR产物没有的话应该没扩增。如果您的实验有CT值的话，请问做没做NTC？NTC有没有CT值？
希望对你有用。

==========================================================

我问一下你那个PCR的荧光积累高度是多少？我只有0.5-1 是不是太低了

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:55

荧光积累高度？？不是很懂。这样说吧，在扩增曲线的纵坐标（应该是这个吧）有3种情况，每个情况的纵坐标的数值是不一样的。如果纵坐标是代表“Fluorcscence”所谓的荧光增长值的话，几k到10k又会有的，如果纵坐标是“DATE Rn”的话，log值0.1到1啊什么的小数值也很正常，就是线性数值0.1到100也可能的。

============================================================================================

所以不必在意那个数值，如果你非要看荧光增长值（也许就是你说的荧光积累高度吧），可以调到“component”界面来看

作者: 鲁西西 时间: 2011-10-6 12:56

用软件Primer 5做引物设计时，那个序列是cDNA序列或直接将miRNA的序列中的U改成T

作者: 鲁西西 时间: 2011-10-6 12:56

用软件Primer 5做引物设计时，那个序列是cDNA序列或直接将miRNA的序列中的U改成T?如：GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU把其中的U改成T就输入DNA序列中行不行啊？

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:56

不知道PP5有没有自动换算U————>的功能，忘记了，你可以都试试看啊。

不知道其他战友用过没？？

作者: 雪花子 时间: 2011-10-6 12:57

楼主您好，我也是刚开始做RT-PCR，有几个问题想向您请教一下
1。我想分离血液中的单个核细胞，再从单个核细胞中提取总的RNA检测microRNA，请问是不是可以用Trizol提取总的RNA，还是一定要买特异性的microRNA专提试剂盒
2.在我查阅的外文文献中基本上绝大多数都是用ABI公司的Taqman探针法或者茎环法做的，基本上没有使用染料法检测microRNA，是不是因为探针法特异性高，能特异性的检测成熟的microRNA，避免了前体的干扰，因此SCI的文章不接受染料法做的microRNA的结果
，必须使用探针法或者茎环法这种特异性高的检测方法才可
3.使用探针法检测，是不是常规预先需要使用染料法摸索反应条件？
4。探针法所需要的引物和特异性探针是不是均可以向ABI公司购买？检测一条成熟的microRNA所需试剂（以ABI公司产品为例），大概需要多少费用
非常感谢楼主能百忙之中能解答，谢谢了

作者: 浆果儿cc 时间: 2011-10-6 12:57

lz你好！新手多多指点我想从血浆中提取microRNA 实验还在设计中有几个地方不是很明白
1.血浆中的microRNA含量很少，前期是怎么处理的啊？？2.把论坛的帖子看了又看，才稍明白：要想发好点的文章的话，基本上就要用 LOOP 引物（ABI专有的）
3.检测要用探针法不能考虑染料法？？
谢谢

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:58

楼主您好，我也是刚开始做RT-PCR，有几个问题想向您请教一下
1。我想分离血液中的单个核细胞，再从单个核细胞中提取总的RNA检测microRNA，请问是不是可以用Trizol提取总的RNA，还是一定要买特异性的microRNA专提试剂盒
2.在我查阅的外文文献中基本上绝大多数都是用ABI公司的Taqman探针法或者茎环法做的，基本上没有使用染料法检测microRNA，是不是因为探针法特异性高，能特异性的检测成熟的microRNA，避免了前体的干扰，因此SCI的文章不接受染料法做的microRNA的结果
，必须使用探针法或者茎环法这种特异性高的检测方法才可
3.使用探针法检测，是不是常规预先需要使用染料法摸索反应条件？
4。探针法所需要的引物和特异性探针是不是均可以向ABI公司购买？检测一条成熟的microRNA所需试剂（以ABI公司产品为例），大概需要多少费用
非常感谢楼主能百忙之中能解答，谢谢了

==============================================================================================================

1、既然颈环状的RT引物，就不需要刻意提取MiRNA了（单细胞本来RNA就不多），由于单纯Trizol分层提取的RNA中MiRNA的的量比较少，既然楼上的经费比较充足，还是在Trizol处理后过下柱吧（可以收集miRNA的KIT的柱子）。
2、颈环RT引物和探针的PCR方法特异性确实比染料法高（您也知道MiRNA的PCR片段太短，用染料法会有二聚体干扰），当然，在前期为了节省成本，先用染料法优化好RT引物、PCR引物后再设计探针会比较好一点（周期可能较长）。至于发外文用什么或者有什么规定我也不清楚，我个人以为你说得有道理。
3、当然不一定必须使用染料法摸索。如果RT引物和探针买的话，直接用就可以了。价钱每个地方可能不一样吧，你最好问下AB的代理或者销售，也许他们有啥优惠活动呢（YY下）。
4、我是买了AB 的内参的RT引物和PCR引物探针的一套，然后参考文献说明自己设计RT引物、PCR引物和探针，用AB的做参照。毕竟我的经费不多。
希望对您有所帮助。

作者: avi317 时间: 2011-10-6 12:58

lz你好！新手多多指点我想从血浆中提取microRNA 实验还在设计中有几个地方不是很明白
1.血浆中的microRNA含量很少，前期是怎么处理的啊？？你感觉用多少ML的血提取比较合适？我看了有篇文献报道说外周血标本离心以后-80℃保存？能保存多长时间啊？但是他先把血液离心后可以保存到-80℃，做的时候用的是试剂盒（mirvana PARIS Ambiton）由于经费问题不能考虑用试剂盒。按照常规方法提取总RNA吗？这样做可以吗？？
2.把论坛的帖子看了又看，才稍明白：要想发好点的文章的话，基本上就要用 LOOP 引物（ABI专有的）
3.检测要用探针法不能考虑染料法？？
谢谢

===============================================================================================================

请问是全血还是血浆啊？？RNA含量差别老大的。如果血浆的话，建议越多越好咯（本人没做过血浆的，感觉有些难度，说的不对表喷我），由于MiRNA很短，一般RNA降解了它也不会降解，所以不用担心（如果总RNA还有他用则另当别论）。就像上面说的一样，一般Trizol分层方法的MiRNA得量不是很高，你可以用普通方法试验下，看看内参CT有多少，如果太靠后的话，你需要改进试验方法了。
其实颈环状引物也可以用染料法的（当然染料法由于方法本身有所局限）。但是就楼上的战友考虑的：会不会对发外文有影响不得而知。
楼主一家之言。各位战友不要客气啊，随便喷啊

作者: 红豆冰 时间: 2011-10-6 12:59

请问是全血还是血浆啊？？RNA含量差别老大的。如果血浆的话，建议越多越好咯（本人没做过血浆的，感觉有些难度，说的不对表喷我），由于MiRNA很短，一般RNA降解了它也不会降解，所以不用担心（如果总RNA还有他用则另当别论）。就像上面说的一样，一般Trizol分层方法的MiRNA得量不是很高，你可以用普通方法试验下，看看内参CT有多少，如果太靠后的话，你需要改进试验方法了。
其实颈环状引物也可以用染料法的（当然染料法由于方法本身有所局限）。但是就楼上的战友考虑的：会不会对发外文有影响不得而知。
楼主一家之言。各位战友不要客气啊，随便喷啊

================================================================================================================

全血里面血细胞里面应该含有很多microRNA吧我做的是血浆里面相对来说少一些我们实验室设计的引物都是商品化的microRNA全套引物用的也是染色法提血浆里的总RNA（然后rt-pcr区分）吧，应该是这个意思吧他的具体流程是什么啊？？

作者: 红豆冰 时间: 2011-10-6 12:59

可能TRIZOL LS invitrogen 比较贵只知道血标本：试剂=1:3，也不知道要提多少ml的血浆才能够做rt-pcr 要是标本多的话估计也只能考虑国产了谢谢

作者: 8黑眼圈8 时间: 2011-10-6 12:59

关于3'引物，我最近用了一个叫Bioo Scientific的公司的盒子，他们用的是另一种技术，直接在miRNA3'端连接接头然后通过接头对应引物序列完成全部miRNA的反转录，我用total RNA和富集的miRNA都试了下，效果不错。非广告。LZ对这种方法也许可以补充下。

作者: avi317 时间: 2011-10-6 13:00

关于3'引物，我最近用了一个叫Bioo Scientific的公司的盒子，他们用的是另一种技术，直接在miRNA3'端连接接头然后通过接头对应引物序列完成全部miRNA的反转录，我用total RNA和富集的miRNA都试了下，效果不错。非广告。LZ对这种方法也许可以补充下。

=============================================================================================================

不知道这种方法与上两种方法比较怎么样？兄弟可以把这个产品的实验方法发下或者把该公司的说明书影印一份，供大家参考。或者您以上方法都用过，希望给个参考信息。

我的本意是提供一个集中的关于MiRNA的平台，大家可以在这里互通有无。所以希望广大有经验的战友多多提供意见以及帮助，而不是光有我在这里班门弄斧。

作者: PINK 时间: 2011-10-6 15:13

最近我再次查阅了资料，发现有比较少的文献使用了染料法检测了microRNA，而且是5年前的文献，就是不知道，现在的SCI杂志还会不会接受染料法的结果，但是主流杂志一般是推荐探针法，灵敏度，特异性高，希望各位战友对于SCI杂志对染料法是否能用于检测microRNA，提出宝贵意见。

作者: 还是孩子 时间: 2011-10-6 15:15

提取的卵巢组织总RNA浓度还可以，就是OD260/OD280偏低，不知道对后续的荧光定量有没有影响？

作者: 菠萝菠萝蜜 时间: 2011-10-6 15:16

国内就会赶风，没想到现在有这么多人做小RNA

不错我也正在测血浆中的microRNA 受益匪浅

作者: 豆荚 时间: 2011-10-6 15:17

我最近做miRNA的QRT-PCR，反转录引物和PCR引物都购自广州某公司，将目的miRNA和U6的反转录引物加到同一管中进行逆转录，后首先跑了一次普通PCR，发现在100bp附近都有明显条带。在正式QRT-PCR之前尝试将模板倍比稀释做了下标准曲线，发现U6的扩增效率为0.97，而目的基因的扩增效率为0，即无论我如何稀释样本，detaCT值不变，溶解曲线也都是单峰。我考虑是目的基因的反转录或PCR引物有问题，请问各位同道，是否碰到此类情况，该如何解决，是否有可靠的公司能够代替设计合成此类引物。

作者: =菓子= 时间: 2011-10-6 17:27

我的实验又失败了，555555.我想问一下，你们的试剂一般哪里买的，最近一家试剂代理说什么TIANgen(天跟)microRNA试剂盒，tiangen好像是国内的厂家，试剂的可信度应该比较低吧？买试剂应该到哪里买比较好点？有microRNA试剂盒吗？哪家的？哥哥姐姐们，给我的建议啊。你们试剂都哪里买的？跟我分享一下你们的经验？谢谢了。55555，做实验好苦啊。。。。。

作者: tears 时间: 2011-10-6 17:27

楼主，说说实验数据分析这块的内容吧，对这部分很迷茫，谢谢，嘿嘿。

作者: tears 时间: 2011-10-7 10:22

楼主，您好，我想问一下一般做定量PCR的时候，选择什么来做reference,我用的是ABI的仪器，我一般用版内的一个标本来做内参，但分析结果的时候，很不稳定，所以想请教一下；还有，如果多次少量分批次做定量PCR，会不会因为每次选择的reference不一样，而影响把不同批次的结果合并分析时的最终结果，谢谢！

作者: tears 时间: 2011-10-7 10:24

大哥，大姐们，我又回来了，我的实验又失败了，555555.我想问一下，你们的试剂一般哪里买的，最近一家试剂代理说什么TIANgen(天跟)microRNA试剂盒，tiangen好像是国内的厂家，试剂的可信度应该比较低吧？买试剂应该到哪里买比较好点？有microRNA试剂盒吗？哪家的？哥哥姐姐们，给我的建议啊。你们试剂都哪里买的？跟我分享一下你们的经验？谢谢了。55555，做实验好苦啊。。。。。

================================================================

我用的是ABI的试剂盒，已发表的文章中用这个产品的人比较多，就是价格肯能高一点。

作者: 8黑眼圈8 时间: 2011-10-7 10:25

强烈要求楼主说说数据分析的问题，呵呵

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-10-7 10:26

不知道这种方法与上两种方法比较怎么样？兄弟可以把这个产品的实验方法发下或者把该公司的说明书影印一份，供大家参考。或者您以上方法都用过，希望给个参考信息。

我的本意是提供一个集中的关于MiRNA的平台，大家可以在这里互通有无。所以希望广大有经验的战友多多提供意见以及帮助，而不是光有我在这里班门弄斧。

==============================================================================================================

这种方法是一个叫做MiraMas的kit中所使用的，制造商是美国的Bioo Scientific公司。我给它起的名字叫通用接头连接法：
在RT步骤，该kit通过试剂盒内含的特殊ligase连接5’端腺苷化且3’端封闭的寡核苷酸接头(Adenylated 3’ Ligation Adapter)于所有miRNA的3’末端，然后通过与该接头序列互补的3’端引物经M-MLV反转录酶将所有miRNA同步反转录成cDNA。

主要优点：
1.比加A尾法更高的反转录效率：
"The advantage of adding the 3' adapter sequence using RNA ligase as used in MiraMas kit, provides higher specificity for priming the reverse transcription step and also the binding site for the Reverse PCR primer only at the 3' ends of the RNAs, compared to using polyA polymerase to add homopolymeric A's followed by hybridization of the oligo dT/adapter to provide the binding sites for RT and Rev PCR primer. The problem with the polyA approach is that the oligo dT can hybridize to internal homopolymeric A regions in mRNAs, instead of only to 3' end."

2.更多的单样品miRNA检测数量：
"Each MiraMas reaction can be used to make cDNA library to allow for analysis of 10's - 100's of microRNA targets (depending on mass amount of input RNA), compared to Qiagen kit each reaction only makes enough cDNA for around 5 target microRNAs. And Qiagen kit does not allow flexibility to use high or low input amounts of RNA. Using the low input amounts, researcher can process lots of samples from one kit."

作者: 冰儿0109 时间: 2011-10-7 10:26

我也是用U6作为内参，是鸡上的U6，参考的是别人文章中报道的：
Chicken small nuclear RNA U6 (GCAGGGGCCAUGCUAAUCUUCUCUGUAUCG)
was used for normalization. The expression levels of novel miRNAs were measured in terms of threshold cycle value (CT) and normalized to U6 using 2-ΔΔCT [72].
我们根据这个序列设计引物，因为这个序列本身比较长，所以我们只取了一部分大概20nt左右，和其他miRNA一样也是进行Stem-loop RT引物设计，然后反转录，最后设计上下游引物进行定量。
但是定量后发现CT值上不去，都在24-28之间徘徊，有的达到了30，我们想了2个方案解决这个问题：
1. 买公司设计好的U6，但是U6多是人和小鼠上的，不知道拿到鸡上是否好用，而且ABI的U6是探针法设计的，我们用的是sybrgreen法定量。所以这个方法似乎不可行

2. 换一下内参，我看到有人直接用GAPDH等作为内参基因，不知楼主对这方面了解多少？我们实验室用过28s, 是用来做普通的基因表达定量的。可以用于miRNA定量吗？如果拿来作为miRNA的内参，是直接可以用（像普通的基因表达实验一样，直接用T18把RNA反转成cDNA）还是要走其他miRNA定量的程序呢，即从序列中截取一段20nt左右的序列进行stem-loopRT引物设计和后面的定量

希望LZ指教，谢谢！

作者: 小蜜蜂 时间: 2011-10-7 10:27

请问群里的大侠们，提取miRNA要求的OD值是多少呀？

作者: wawa 时间: 2011-10-7 10:27

贴主，你好。我是一个初学者，现在要写一份标书，急需一份组织和血液标本miRNA测定的具体实验流程。

我们有足够的血液和组织标本，目的是测定其中和肿瘤相关的miRNA。谢谢！！！

作者: 长发piaopiao 时间: 2011-10-7 10:27

请教lz和各位高人，我用加尾法检测miRNA，提取总RNA后加尾纯化，然后使用miRNA通用逆转录引物合成cDNA，合成的cDNA用于实时荧光定量PCR（sybrgreen法）检测miRNA，可以看到扩增曲线，但是U6做内参没有看到扩增曲线，使用oligo（dT）逆转录的cDNA可以看到U6的扩增曲线，请教是什么原因？怎么解决？谢谢！

作者: fangxiang 时间: 2011-10-7 10:28

楼主您好，我也是刚开始做RT-PCR，有几个问题想向您请教一下
1。我想分离血液中的单个核细胞，再从单个核细胞中提取总的RNA检测microRNA，请问是不是可以用Trizol提取总的RNA，还是一定要买特异性的microRNA专提试剂盒
2.在我查阅的外文文献中基本上绝大多数都是用ABI公司的Taqman探针法或者茎环法做的，基本上没有使用染料法检测microRNA，是不是因为探针法特异性高，能特异性的检测成熟的microRNA，避免了前体的干扰，因此SCI的文章不接受染料法做的microRNA的结果
，必须使用探针法或者茎环法这种特异性高的检测方法才可
3.使用探针法检测，是不是常规预先需要使用染料法摸索反应条件？
4。探针法所需要的引物和特异性探针是不是均可以向ABI公司购买？检测一条成熟的microRNA所需试剂（以ABI公司产品为例），大概需要多少费用
非常感谢楼主能百忙之中能解答，谢谢了

==============================================================================

好像使用染料法做的microRNA的结果，也可以发国外文章，最近JTO上发的有一篇，使用的就是染料法。

作者: 大仙 时间: 2011-10-7 10:29

现在我做的是从石蜡包埋组织中提取microRNA。有做这方面的吗？请求交流

作者: 岸上的鱼 时间: 2011-10-7 10:29

非常感谢楼主的经验分享！楼主之前有说做过石蜡组织中提取miRNA，能不能分享下经验？提取出来的RNA，需要稀释到多少的浓度用于RT？是否样本间的RNA均需要稀释到同一浓度？

作者: 章鱼小丸子 时间: 2011-10-7 10:30

我想知道最后出来的结果怎么分析

作者: 桔囿 时间: 2011-10-7 10:30

lz你好

我是新手，想做miRNA的QRT-PCR，您上面说如果是细胞的话，直接用Trizol提就好，请问反转录试剂盒用哪个公司比较好？文献上大多是用Taqman microRNA array kit，由于经费不多，我想用染料法，想求些好的建议。对于茎环引物一般用哪个公司设计？如果要验证七八个的话，一共下来要多少钱？问题有些傻，请别见笑>

作者: lixi559 时间: 2011-10-7 10:31

大家反转录试剂盒用的哪个公司的呀急需

作者: #甜# 时间: 2011-10-7 10:32

大家有做miRNA 转染的吗是怎么做的用的什么载体具体方法是什么

作者: 蚊子 时间: 2011-10-7 10:33

请问提血浆microRNA和PBMC microRNA在逆转录之前有没有区别，如果有，是什么？其实我还是没看明白stem-loop法和poly（A）法的区别，求教！谢谢。

作者: 爱哭鬼 时间: 2011-10-7 10:33

我是提取组织的miRNA做real timePCR，现在用trizol提取了总rna，打算采用加尾法反转录，看首页上说加尾法尽量要提取小RNA，还有，不知道Ologod(T)特异引物和Oligod(T)特异引物是打错了呢还是本来就是两种东西。

作者: 园丁## 时间: 2011-10-7 10:33

我现在也在做miRNA的RT-PCR，用的是polyA 加尾，Taq酶探针，扩增条件是：95摄氏度5min ,95度15sec,60度1min, 但是扩增不出来条带，是引物的问题还是应该将扩增步骤改为三步法呢？

作者: qqq111 时间: 2011-10-7 10:34

楼主好~ 请教个问题。我也是做了miRNA芯片，挑了几个差异显著的来做验证。taqman探针和相关RT及PCR的试剂盒都是ABI的。开始是用Trizol提RNA的。预实验结果内参在22个cycle左右，第一个miRNA在18左右，但是其他几个miRNA通通在35个cycle。跟公司沟通过，认为Trizol提取RNA时miRNA损失较多。换了QIAGEN的RNeasy kit来提RNA。再次实验结果，内参和第一个miRNA没太大变化。有一个miRNA提前到32cycle左右。其他的还在35。

实验室的师兄师姐认为cycle在35，结果的可靠性较差。希望能再把cycle提前一点，不知还有没有什么好方法。

请各位不吝赐教。最近因为这个十分挠头~~~

作者: windy+++ 时间: 2011-10-7 10:35

LZ，你在RNA提取中提到的。血液和植物样本需要前期处理后再用Trizol＋氯仿或用专门的Kit抽提。

要如何前期处理？

作者: pou 时间: 2011-10-7 10:36

最近在做血浆miRNA检测。目前想先设计合成茎环结构引物，用sybgreen方法检验一下引物的好坏。到正式实验时，再订制探针做。存在的疑问就是：国内有几家公司，比如上海闪晶和上海基康，都可以合成MGB探针，考虑到价格和时间问题，ABI的货期太长，而且很贵，我想选择国内的探针做做。

不知道大家伙有没有人试过国内的MGB探针，效果好坏与否都来说说啊。。。谢谢！

作者: 不懂 时间: 2011-10-7 10:37

经过我个人的经验来看，推荐做miRNA的童鞋都采用茎环引物来反转，跟试剂盒比起来贵不了多少点点钱滴，至少不会被某些不良商家用特异性下游引物要挟啊

作者: 椰子叶子 时间: 2011-10-7 10:37

楼主啊楼主我请教你我什么我的PCR结果曲线高度不够，而且电泳没跑出来是怎么回事啊，大哥请指教

=====================================================================================================

我替楼主回答一下吧。

你说的是荧光值不高是吧，那Ct值怎么样，要是Ct值还可以的话结果还算理想，然后熔解曲线特异性分析，做QPCR一般不用跑电泳的。

作者: 椰子叶子 时间: 2011-10-7 10:37

PDF格式错误太多了。CAJ格式的附上。

============================================================================

我查了下文献，有蛮多文章用的invitrogen的TRIZOL LS 试剂提血清/血浆miRNA，楼主可以关注一下。

作者: 椰子叶子 时间: 2011-10-7 10:38

lz你好

我是新手，想做miRNA的QRT-PCR，您上面说如果是细胞的话，直接用Trizol提就好，请问反转录试剂盒用哪个公司比较好？文献上大多是用Taqman microRNA array kit，由于经费不多，我想用染料法，想求些好的建议。对于茎环引物一般用哪个公司设计？如果要验证七八个的话，一共下来要多少钱？问题有些傻，请别见笑>

===============================================================================================================

有几家公司据我了解提供验证好的引物，像ABI、qiagen、genecopoeia等，你可以上网查下或者打电话去客服问问。个人觉得现在不管是基因还是miRNA的表达量检测都有不少公司提供现成的引物，可以节省大量的精力去设计引物和摸索条件，非常方便。

作者: 喜乐lele 时间: 2011-10-7 10:39

我是新手，想请教一下各位加尾法大家谁家的试剂盒比较好？

作者: 冷太阳 时间: 2011-10-7 10:39

我用了TAKARA加尾法逆转录试剂盒，结果扩增出来好多都有两三条带？有些可能是前体，那么前体的出现影响分析吗？另外，我测序了一个microRNA,结果发现是一个混合物，这个microrna后面还跟了9个碱基？加尾法还能用吗？

作者: 飞天小鹿 时间: 2011-10-7 10:40

你们好请问知道了某种MiRNA的逆转录引物、上下游引物，可以手工计算它的PCR产物长度吗？是不是就是上下游引物之间的片段（含引物），好心人帮忙解答啊

作者: 云端ing 时间: 2011-10-7 10:40

有什么问题欢迎大家来这里讨论。

================================================================================================================

你好，请教您一个问题，您做过miRNA前体的qRT-PCR检测吗？我现在想做pri-、pre-、mature miRNA三个水平的qRT-PCR检测，请问有什么好的建议吗？用什么kit 好呢？谢谢。

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)