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标题: [精华]酶切问题讨论专栏 [打印本页]

作者: 3N4G    时间: 2011-10-7 16:04     标题: [精华]酶切问题讨论专栏

[精华]酶切问题讨论专栏    [转载]


如何选择酶切缓冲液,如何提高酶切效率,尤其是PCR产物的酶切、双酶切、特殊酶切,总结了以下几点,希望对大家有帮助,欢迎补充!

1.PCR产物的酶切。
PCR产物的酶切与引物上引入的保护碱基有很大的关系,所以设计引物的时候就应该注意到这一点,如何选择保护碱基,具体参见NEB网站上关于保护碱基的资料:

PCR产物的酶切相关的帖子:
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/242899_1.html')

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/818980')

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/620693')

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/720799')

2.加了保护碱基可能也会遇到切不动的问题,切不动可以从以下方面考虑:
(1)酶切缓冲液。每种酶都有公司提供的最佳缓冲液,它们的差别只是离子浓度与体系的不同,如Na、k、Mg等,还有PH值及缓冲体系(一般Tris-HCl),另外酶加甘油和DTT作为保护剂。在双酶切的时候常会遇到两种酶有各自的缓冲液,要达到高酶切效率,选择是个问题,如果酶切时间和量足够,解决的方法:
(A)使用其中一个酶的缓冲液,但要考虑到另一酶的反应效率,反应效率如何,可以查查酶在不同buffer里的效率参数,具体见公司网站,如NEB提供了很好的buffer参数:
cuturl('http://circuit.neb.com/neb/tech/tech_resource/restriction/buffers/buffer_chart.html')。
(B)使用它们的通用的缓冲液,使两种酶在同一缓冲液里达到也足够的酶切效率;没有通用的BUFFER怎么办呢? 分两次酶切。即先用一种酶切,胶回收后再用另一种酶切。一般先低盐后高盐,这种方法保证了在各自的酶切缓冲液中都得到最大的酶切效率,但缺点是要回收,损失大 ;
(C)克隆到T载体中,值得推荐的方法,克隆到T载体中,不须要考虑受这个条件的限制,酶切位点也可以用T载体上自带的。

(2)酶切温度。酶切温度也很重要,一般的酶切最适温度为37度,有些特殊的酶的反应温度不同,如Sma Ⅰ为30度。双酶切时这种情况下最好分开切,先低温后高温。

(3)酶切时间。酶切时间直接影响到酶切是否完全,一般为1-3h,这个时间已经足够,对于一些活性较好的酶,30min就可以酶切完全,建议在酶切1h后取5ul跑电泳以鉴定酶切效率;PCR产物的酶切时间较长,一般过夜。

(4)酶失活。如果使用酶解冻后放置太久,可能导致酶失活。这种情况较少见,只能换新酶。如果拿了不同公司的酶,buffer也不一样,怎么办?放心,可以用不同公司的酶进行双酶切,一般不会有问题的。可以先查查NEB的酶在不同缓冲液中的活性百分比,选择它们都有适中活性的buffer,每个公司生产的酶反应缓冲液针对特定内切酶是最合适的!

(5)酶切体系。选用多大的酶切体系取决于你的样品浓度,在双酶切的时候为了得到质量高的电泳图,尤其插入的是小片段DNA,酶切后产物量较少,可以增加酶切重组DNA的量和增加上样量,建议酶切前测定一下DNA浓度或跑电泳看看DNA有多浓,做到心中有数。

相关帖子
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/886961')

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/458396')

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/893847')

关于保护碱基的资料:

Cleavage Close to the End of DNA Fragment1.doc (104.5k)

作者: +田田+    时间: 2011-10-7 16:05

请问前辈:为什么双酶切时要先切低温再切高温?
如果酶切过夜会影响酶切效果吗?

作者: coolcool    时间: 2011-10-7 16:06

主要是考虑到酶活性的维持。
温度对酶的活性影响很大,温度高,容易造成某些酶的失活;双酶切时,由于有2种的限制酶存在,2种酶可能有不同的最适反应温点,当1种酶在其最适温点反应时,为了不使另1 种酶降解或失活,所以双酶切时要先切低温再切高温。

作者: seven7    时间: 2011-10-7 16:06

请问PCR产物酶切过夜,对连接没影响吗?
作者: 邀月    时间: 2011-10-7 16:07

紧急求助!万分感谢!!!构建vector 3个月没结果!
我的载体是PstI单酶切,脱磷。目的片段是PCR产物切胶回收PstI单酶切(切2.5h,引物设计加6个保护碱基),,然后又切胶回收,再连接,阴性对照长一些兰斑(可能脱磷不彻底),但样品只长几个白斑,鉴定全是假的。请问高手问题出在哪?是不是目的片段没切动导致没连上?载体是pCAMBIA1300, 目的片段9.7kb。

作者: koook5695    时间: 2011-10-7 16:07

你的目的片段9.7kb,有点大, 胶连有点困难了.可以考虑液连.用Agrose酶把你的胶溶解.并提高目的片段的纯度和浓度.

还有就是你的PCR产物PstI单酶切的问题,因为你跑胶看不出酶切的效果.可用一有PstI酶切位点的环质做对照一起酶切,可以看出部分问题.

你的载体脱磷也确实是个麻烦,每次做阴性对照也很对,但脱磷的程度要看你自己的掌握了,脱磷不彻底和太过了也不好.不过,CIP一定要保证活性.最好用

新的.

作者: applebook=213    时间: 2011-10-7 16:09

我个人认为,一般不到万不得已,没必要先回收再酶切,损失太大,绝大多数双酶切可在1×通用buffer中先切1小时,再在2×通用buffer中切1小时,可解决绝大多数酶切问题。
作者: applebook=213    时间: 2011-10-7 16:09

我个人认为,一般不到万不得已,没必要先回收再酶切,损失太大,绝大多数双酶切可在1×通用buffer中先切1小时,再在2×通用buffer中切1小时,可解决绝大多数酶切问题。
作者: applebook=213    时间: 2011-10-7 16:10

不过先回收,也能保证酶切的效率,如果PCR的产物量满意的话,回收的损失可以忽略不计。毕竟酶切的效率对于克隆化相对更重要一些。  
作者: 荷塘青蛙!    时间: 2011-10-7 16:10

过去,早期的内切酶有星活性,过度酶切能给产物切的七零八落,现在好像已经没有这个问题了,早些年曾经遇到过把产物切碎了的情况。  
作者: fangxiang    时间: 2011-10-7 16:11

是不是引物上加酶切位点的才需要保护碱基?
我的酶切位点都在PCR产物内部包含,还需要在引物上加保护碱基么?  

作者: 3N4G    时间: 2011-10-7 16:11

不需要的,连接到T载体上直接就可以酶切鉴定!
作者: 丸子妹    时间: 2011-10-7 16:11

我的PCR产物的酶切位点XbaI的保护性碱基是CG,HbaI也是CG,会影响我的酶切吗,我十分担心,高手能指点一下吗
作者: 二丫头466    时间: 2011-10-7 16:12

我的质粒是pcdna3.1+cfp-c1 , 6000多bp!有一个not1的酶切位点,我酶切了很多次都没有成功?酶切都是2条带。我用50ul体系,加了15ul的质粒(100ng/ul),2ul的酶,发应了10个小时还没有切动。请高手指点,谢谢了!
作者: =菓子=    时间: 2011-10-7 16:13

我现在双酶切一个T载体连接产物,用的是和EcoRI,先用BamHI30度切5小时,之后沉淀线性DNA,方法是:加入1/10体积的乙酸钠和风细雨2.5体积的无水乙醇,18000转15分钟离心,再加入70%乙醇15000转离心10分钟,最后等乙醇挥发干净了再加入EcoRI的酶切体系37度切5小时.可是结果总是不对.本应该是2000和3000两条带,可是总是出现不正确的带,或者根本就乱七八糟,怎么回事啊?请大家 帮帮忙!
作者: =菓子=    时间: 2011-10-7 16:13

另外我还要双酶切pcDNA3.1,但是因为也是用的BamHI和EcoRI,所以切下来与没切开的片段相差只有几十bp,电泳根本看不出来,那我如何才能判断出来到底有没有切下来呢?难道只能等连接上了才知道吗?
作者: 3N4G    时间: 2011-10-7 16:14

1)你首先要确定片段是否已经连接到T载体上;EcoR I和BamH I有共有的buffer,就用BamH I的自带buffer试一下。
2)确定BamH I和EcoR I的酶切效率,你可以找一个其它的单酶切位点,和BamH I或EcoR I双酶切,注意切下来的片段最好能达到400bp左右,酶切总体积可以加大些!

作者: 森林木    时间: 2011-10-7 16:14

我其实这三个月一直在这上面打转,酶切,连接,转化。我把我的问题与经验提供出来,一则借鉴,再则希望那位高手指点一下。我是把目的基因与T-VECTOR连接后再进行酶切,这样做酶切效果好,而且也方便,你还可以不用加保护碱基,有时连酶切位点也不用加,直接用T-VECTOR上的。每切的好坏与你提的质粒有关,如切不动,可以在提的时候多洗几次。切碎则与盐有关。时间一般在4小时之内,时间过长会出现乱切,下一步连不上。一般情况下,4小时切不动,再长也不行。我的烦恼是,我的双切载体与目的基因都很好,单带,很清晰。转化过程也反复验证没有问题,但就是得不到阳性转化子,问题集中在切胶回收,连接这几步。请高手指点迷津,切磋一下。
作者: 3N4G    时间: 2011-10-7 16:15

得不到阳性转化子,我想应该分析:
1)胶回收。为了获得较多的酶切产物,应该扩大酶切体积,回收最好取几3ul电泳,以检测回收效率如何,也可以用分光光度计测定回收产物浓度,洗脱时取少量的水可以浓缩产物。
2)连接问题。连接我一般10-15ul的反应体积,载体和PCR产物摩尔比一般为1:1-1:3,T4 dna ligase很重要,连接的同时做一个阳性对照以检测连接效率。连接最好16度水浴连接过夜。
3)感受态的问题。转化之前要保证感受态细胞的转化效率较高,如果你能得到20个左右的转化子已经足够了。自制感受态一定要用pUC18/19检测转化效率。
4)抗性平板问题。AMP的浓度50-100ug/ml都行,最好用新制备的平板,LB的高压时间不要太久,15min足够,以免破坏培养基的营养。

作者: 3N4G    时间: 2011-10-7 16:16

新英格兰公司提供的:双酶切buffer的选择
注:
U
Supplied with its own unique reaction buffer that is different from the four standard NEBuffers. Its compatibility with the four standard NEBuffers is indicated by the chart.

BSA
Supplied with a separate vial of bovine serum albumin (10 mg/ml). To obtain 100% activity BSA should be added to the 1X reaction mix to a final concentration of 100 µg/ml.

SAM
Supplied with a separate vial of S-adenosyl-methionine (SAM). To obtain 100% activity, SAM should be added to the 1X reaction mix as specified on the product data card.

dd
When performing a double digest with this enzyme, this NEBuffer is recommended because it minimizes star activity.

*
Purified by scientists at SibEnzyme and supplied with a SibEnzyme buffer (B, K, O, W or Y) which ensures 100% activity. Its compatibility with the NEBuffer System is indicated on the chart

NR
This buffer is not recommended for use with with this enzyme

Buffer Compositions
(1X): NEBuffer 1 (yellow): 10 mM Bis Tris Propane-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT (pH 7.0 at 25°C). NEBuffer 2 (blue): 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DTT (pH 7.9 at 25°C). NEBuffer 3 (red): 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM DTT (pH 7.9 at 25°C). NEBuffer 4 (green): 20 mM Tris-acetate, 10 mM magnesium acetate, 50 mM potassium acetate, 1 mM DTT (pH 7.9 at 25°C).

DetaiLed information :cuturl('http://circuit.neb.com/neb/tech/tech_resource/restriction/buffers/buffer_legend.html')


图片附件: 24515305_snap.jpg (2011-10-7 16:16, 48 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8657


作者: 森林木    时间: 2011-10-7 16:17

得不到阳性转化子,我想应该分析:
1)胶回收。为了获得较多的酶切产物,应该扩大酶切体积,回收最好取几3ul电泳,以检测回收效率如何,也可以用分光光度计测定回收产物浓度,洗脱时取少量的水可以浓缩产物。
2)连接问题。连接我一般10-15ul的反应体积,载体和PCR产物摩尔比一般为1:1-1:3,T4 dna ligase很重要,连接的同时做一个阳性对照以检测连接效率。连接最好16度水浴连接过夜。
3)感受态的问题。转化之前要保证感受态细胞的转化效率较高,如果你能得到20个左右的转化子已经足够了。自制感受态一定要用pUC18/19检测转化效率。
4)抗性平板问题。AMP的浓度50-100ug/ml都行,最好用新制备的平板,LB的高压时间不要太久,15min足够,以免破坏培养基的营养。

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谢谢你的建议,是的我也考虑了这几点。(1)胶回收,由于酶切是上1下5,在回收时是否会断裂,加热60-70度是否影响。(2)连接,第一,在分子克隆上提到,若连接困难,可能末段封闭,因此建议连接之前45度保温5分钟。这一步是否必要。第二,体系(10ul),我一般是凭感觉,若回收的载体中度量(5微生)目的片段微弱,比例如何好。第三,连接酶。我不知到有多长时间了。对照我是否可以用单酶切看连接效果。(3)感说态是自己制的,用载体直接转过,没问题。(4)平板经常出问题,有时不长,有时长的不是转化子,问题在于到平板时不能太凉,结果抗生素没混匀。另外,还有一个情况,我前面在做T载体转化时,也是转不出来,是一个老师转的。情况与此差不多。综合这些情况,再请教以下?多劳驾了。

作者: 3N4G    时间: 2011-10-7 16:17

(1)按说明书做,应该不会断裂!
(2)连接与末段封闭关系不大,主要在于两片段的比例及连接酶质量,回收的载体少,你只能再加大酶切量回收,跑电泳太浪费,测定浓度比较省事。
(3)T载体转化关键的还是上面提到的那几个,重提一句,酶很关键。
祝成功!

作者: 胖小妮子    时间: 2011-10-7 16:18

1、我用的是MBI的内切酶,HpaI和XbaI,但我PCR产物的保护性碱基是CG,会影响酶切吗?电泳显示质粒酶切后跑慢了,连接后转化,试验组(和目的片断连接的质粒)和只用酶切过的质粒做的对照都在平板上生长了。密度还差不多,是否说明我酶切不好?
2、用自己的质粒连接的转化产物可以送出测序吗?还是一定要做T载体连接?

作者: 小鱼鱼    时间: 2011-10-7 16:23

EcoRI 和BamHI是能够同时进行酶切的,我做过,效果很好。用的是NEB的美和Buffer。 双酶切时应该用EcoRI的 buffer.
我现在遇到的一个问题是: PCR产物连接到pGEM-T载体后测序发现,我当初引物设计时加上的一个EcorI的酶切位点不见了,末端少了 两个碱基,GA。 我用的酶是生工的Taq plus, 最初我坚信是引物的问题,可后来我看到Taq酶有5‘-3’外切酶活性,不知是不是在PCR 是引物的‘5’端被切掉了两个碱基,导致了酶切位点的消失。 恳请大虾指点迷津。
作者: 小鱼鱼    时间: 2011-10-7 16:23

EcoRI 和BamHI是能够同时进行酶切的,我做过,效果很好。用的是NEB的美和Buffer。 双酶切时应该用EcoRI的 buffer.
我现在遇到的一个问题是: PCR产物连接到pGEM-T载体后测序发现,我当初引物设计时加上的一个EcorI的酶切位点不见了,末端少了 两个碱基,GA。 我用的酶是生工的Taq plus, 最初我坚信是引物的问题,可后来我看到Taq酶有5‘-3’外切酶活性,不知是不是在PCR 是引物的‘5’端被切掉了两个碱基,导致了酶切位点的消失。 恳请大虾指点迷津。 
作者: 3N4G    时间: 2011-10-7 16:31

我来了三次了,可是每次的问题都没有高手指点啊,主任能帮帮我吗?好郁闷啊。
1、我用的是MBI的内切酶,HpaI和XbaI,但我PCR产物的保护性碱基是CG,会影响酶切吗?电泳显示质粒酶切后跑慢了,连接后转化,试验组(和目的片断连接的质粒)和只用酶切过的质粒做的对照都在平板上生长了。密度还差不多,是否说明我酶切不好?
2、用自己的质粒连接的转化产物可以送出测序吗?还是一定要做T载体连接?

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1)MBI的内切酶还可以,XbaI用过,酶切效率不高,酶切过的质粒做的对照也有转化子,我想肯定没有切完全或酶切后没有胶回收。
2)用自己的质粒连接的转化产物可以送出测序,并不是一定要做TA克隆,PCR产物酶切后可以直接连接到你的载体上。

作者: 3N4G    时间: 2011-10-7 16:31

我来了三次了,可是每次的问题都没有高手指点啊,主任能帮帮我吗?好郁闷啊。
1、我用的是MBI的内切酶,HpaI和XbaI,但我PCR产物的保护性碱基是CG,会影响酶切吗?电泳显示质粒酶切后跑慢了,连接后转化,试验组(和目的片断连接的质粒)和只用酶切过的质粒做的对照都在平板上生长了。密度还差不多,是否说明我酶切不好?
2、用自己的质粒连接的转化产物可以送出测序吗?还是一定要做T载体连接?

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1)MBI的内切酶还可以,XbaI用过,酶切效率不高,酶切过的质粒做的对照也有转化子,我想肯定没有切完全或酶切后没有胶回收。
2)用自己的质粒连接的转化产物可以送出测序,并不是一定要做TA克隆,PCR产物酶切后可以直接连接到你的载体上。

作者: 3N4G    时间: 2011-10-7 16:32

EcoRI 和BamHI是能够同时进行酶切的,我做过,效果很好。用的是NEB的美和Buffer。 双酶切时应该用EcoRI的 buffer.
我现在遇到的一个问题是: PCR产物连接到pGEM-T载体后测序发现,我当初引物设计时加上的一个EcorI的酶切位点不见了,末端少了 两个碱基,GA。 我用的酶是生工的Taq plus, 最初我坚信是引物的问题,可后来我看到Taq酶有5‘-3’外切酶活性,不知是不是在PCR 是引物的‘5’端被切掉了两个碱基,导致了酶切位点的消失。 恳请大虾指点迷津。 

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我想你的猜测有道理,Taq plus的保真效率高,适合长片段(10-30kb)扩增,公司的说明书上有这样的描述:
(1) high fidelity with an error frequency 1.6 / 106 (or 0.0016/103) during DNA synthesis.
(2) Taq Plus increases the efficiency of polymerization reaction, resulting in a great percentage of extenuation reaction complction up to 10 kb to 30 kb. Pfu has a temperature optimum between 72-78 ℃ and remains > 95% active following 1-hour incubation at 95 ℃.

5’端碱基可能与你的酶有关系,最好换其它的酶,如果你要扩增长片段的DNA,可以试一试Takara的Taq Ex。不过高保真与外切酶活性是一个矛盾。

作者: 白白的    时间: 2011-10-7 16:46

我查了一下,还没有说Taq酶能切掉引物5’端碱基的报道。不知主任是否遇到过这种情况。我想该用Pfu, 但他不能直接用于TA克隆。 我的片段有1400bp, 测序后除了引物上有三个碱基错误(两个缺失, 一个错配)外,只有一个碱基与GENEbank 不一样。老板让我在重复一次,说不准就没有错误了因为错配饰随机的。。不知这种可能性大不大。
谢谢主任的回答

作者: 白白的    时间: 2011-10-7 16:46

我查了一下,还没有说Taq酶能切掉引物5’端碱基的报道。不知主任是否遇到过这种情况。我想该用Pfu, 但他不能直接用于TA克隆。 我的片段有1400bp, 测序后除了引物上有三个碱基错误(两个缺失, 一个错配)外,只有一个碱基与GENEbank 不一样。老板让我在重复一次,说不准就没有错误了因为错配饰随机的。。不知这种可能性大不大。
谢谢主任的回答

作者: 森林木    时间: 2011-10-7 16:47

EcoRI 和BamHI是能够同时进行酶切的,我做过,效果很好。用的是NEB的美和Buffer。 双酶切时应该用EcoRI的 buffer.
我现在遇到的一个问题是: PCR产物连接到pGEM-T载体后测序发现,我当初引物设计时加上的一个EcorI的酶切位点不见了,末端少了 两个碱基,GA。 我用的酶是生工的Taq plus, 最初我坚信是引物的问题,可后来我看到Taq酶有5‘-3’外切酶活性,不知是不是在PCR 是引物的‘5’端被切掉了两个碱基,导致了酶切位点的消失。 恳请大虾指点迷津。 

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我想你说的情况比较少见,一般正常的PCR不会出现,另一个关键市,TAQ酶在最后加个T,如果真是你说的,能连到T-VECTOR上,说明T还在,所以Taq酶有5‘-3’外切酶活性的可能性不大。你可以考虑以下原因;(1)引物末端不配对碱基是不是太长,两个保护碱基加6个碱基,引物起码要在 20以上。(2)序列平读是否正确,仔细看一下测序图,机读有时会落掉。至少,你的怀疑理论上是存在的,但是实际中很少,否则,公司怎么敢卖这样的酶。
作者: 森林木    时间: 2011-10-7 16:48

再答楼上问题:
一般册序是不用TAQ酶来扩增的,而用PFU,具体做法是,先用PFU正常扩增,结束后,每管加0。3-0。5微升TAQ酶加尾,72度保温10分钟。即可。

作者: 饭团团    时间: 2011-10-7 16:49

么看来的确是引物合成的问题了,测序峰图我看过了,没错。真是难以想象,一条24个碱基的引物居然有三个错误。 我的引物末端没有家保护碱基, 也就是说只有六个剪辑时不配队的。
作者: 楚留臭    时间: 2011-10-7 16:51

PS: PCR产物肯定连到T载体上了,测序结果正常。
作者: @木木@    时间: 2011-10-7 16:52

请问如果一条PCR产物长500bp,被一内切酶切开后变为两个片段,这两个片段的长度加起来一定等于500bp吗?
作者: 丸子妹    时间: 2011-10-7 16:54

谢谢主任,我的酶切产物是胶回收过的,我现在50微升的体积用了2微升XbaI和1微升HpaI,
1、是不是下次切时应该增加酶量,延长时间;有人说如果酶切不全,就回收后再加酶反复切,这样好吗?
2、非常不幸的是,实验室停了两天电,我的酶还能用吗?老板舍不得买啊。我好想哭啊!

作者: 3N4G    时间: 2011-10-7 16:56

如果PCR产物上只有这一个酶切位点,切开后为两个片段,加起来就等于原PCR产物,即500bp。
作者: #甜#    时间: 2011-10-7 17:00

1.如果PCR产物扩增后直接克隆到T-EASY载体上,是否在设计引物时就不用考虑加保护性碱基的问题了
2.如果所扩增的片段本身就是高GC(>70%),用一些引物设计软件都没有在理想的位点找到合适位点,是否可以不严格遵守引物扩增的基本原则,如3'端不能是高GC,这样扩出来的效果回不回很差?
希望各位战友予以指导.在此先谢过了.

作者: 大桃子同学    时间: 2011-10-7 17:03

对了还有,如果是用高保真的TAQ酶是不是在引物设计时自己就加上A(宝生物的LA TAQ酶).  
作者: 爱哭鬼    时间: 2011-10-7 17:05

1.如果PCR产物扩增后直接克隆到T-EASY载体上,是否在设计引物时就不用考虑加保护性碱基的问题了
2.如果所扩增的片段本身就是高GC(>70%),用一些引物设计软件都没有在理想的位点找到合适位点,是否可以不严格遵守引物扩增的基本原则,如3'端不能是高GC,这样扩出来的效果会不会很差?
希望各位战友予以指导.在此先谢过了.

作者: 3N4G    时间: 2011-10-7 17:07

1)如果PCR产物扩增后直接克隆到T-EASY载体上,可以在设计引物时不用考虑保护性碱基,比较PCR酶切,克隆到T载体效率较高,但我一般都设计保护碱基。
2)可以不严格遵守引物扩增的基本原则,但最好不要有错配,这还要看你的模板来源,之前可以做对比。引物的3端最好为A、G、C,避免是T,但避免3个连续的G或C出现,尤其在在3端。
3)用的高保真的TAQ酶不能在平端双链DNA的3'末端加一个碱基腺苷,最好不用这种酶,如果是长片段产物,可以用其它的Taq 酶。
4)关于PCR产物克隆问题,我觉得可以两条途径进行,TA克隆是一条路,PCR酶切产物克隆是另一途径。

作者: 大桃子同学    时间: 2011-10-7 17:08

谢谢斑竹,可是我克隆的是一个启动子序列,然后拿到报告载体中进行表达,所以一般要求是高保真的酶进行扩增。PCR酶切产物克隆,是不是将产物直接连到目的载体上,还是通过一别的中间载体(如PUC载体)定向连接克隆后再连接到目的载体。(因为刚接触,所以有些问题也许很弱。)
作者: 911    时间: 2011-10-7 17:08

我没有做过启动子序列的克隆,但具体情况具体分析,选择酶切位点很重要,你应该根据你的载体及promotor序列进行综合考虑。
作者: 海鸥crazy    时间: 2011-10-7 17:11

谢谢啦!我把我的一个引物输入到一个引物设计软件中,说其不可用,说3'端自身互补,且过于稳定,请斑竹看看并予以指导.
下游引物5'AAG CTT AGG GCT TCC CAC GTG CGC AG 3'

作者: 3N4G    时间: 2011-10-7 17:11

形成发卡结构关系不大,后续优化PCR反应条件应该能扩出来,我设计的一对引物只有22个base,与目的基因互补的序列只有13个base,打分只有60分,P的产量很高,特异性也很高(质粒为模板)。如果你引物的其它一般原则都具备,先试一试,先合成2OD,合成引物也不是很贵嘛!
作者: 海鸥crazy    时间: 2011-10-7 17:12

对了还是想请问一下,在合成引物时,你们通常用不用HPLC纯化.因为我要扩启动子区,GC含量高,所以较为困难.  
作者: 3N4G    时间: 2011-10-7 17:12

没有吧,引物都是PAGE纯化的,纯度可以达到99%!
作者: free    时间: 2011-10-7 17:13

请教一个问题,请大师们指点。
我用EcoI和XhoI进行双酶切鉴定重组质粒时,切了好几次都没切开,请问有什么原因影响酶切。我用PCR能从重组质粒中扩出目的片段,质粒酶切时我用了15微升,两种酶切用了2小时半,选的是两种酶的通用buffer。

作者: 鸽子不哭    时间: 2011-10-7 17:14

各位帮帮我吧:我的PCR产物回收后,用EcoRI和XhoI双酶切,然后和EcoRI和XhoI双酶切的载体PET30a连接,转化BL-21(DE3)感受态细胞,想进行蛋白的表达,可是做了快一个月了,转化后,一个菌都不长,感受态细胞用空载体检测过,转化率挺高的。PCR用的两条引物,分别加了EcoRI,XhoI得酶切位点,并有三个保护碱基,PCR产物的大小为2.1Kb,因为酶切过只有少数几个碱基去掉,所以不知道PCR产物是否被切出粘性末端。我现在该怎么办呀,那一步出问题我都找不到,PCR产物酶切时间是过夜
作者: 森林木    时间: 2011-10-7 17:17

请教一个问题,请大师们指点。
我用EcoI和XhoI进行双酶切鉴定重组质粒时,切了好几次都没切开,请问有什么原因影响酶切。我用PCR能从重组质粒中扩出目的片段,质粒酶切时我用了15微升,两种酶切用了2小时半,选的是两种酶的通用。

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你的情况基本上与酶切buffer,体系,时间关系不大。如果能切开,2各小时足够了,只回存在酶切不完全。你考虑以下原因;1 根本没转入。菌落PCR假阳性非常多,2 载体提取的不,乙醇或蛋白抽提不净,你可再出提一次,用70%乙醇洗两次,待乙醇挥发干净。
作者: 桔囿    时间: 2011-10-7 17:18

谢谢,我正要重新提取质粒。我做PCR不是用的菌落,是用接种针挑很少的菌落接种LB,培养后取1微升的菌液做为模板进行PCR鉴定的,不知这种情况下的假阳性有多高。以前我转化不成功时PCR基本都是阴性。
作者: 森林木    时间: 2011-10-7 17:19

各位帮帮我吧:我的PCR产物回收后,用EcoRI和XhoI双酶切,然后和EcoRI和XhoI双酶切的载体PET30a连接,转化BL-21(DE3)感受态细胞,想进行蛋白的表达,可是做了快一个月了,转化后,一个菌都不长,感受态细胞用空载体检测过,转化率挺高的。PCR用的两条引物,分别加了EcoRI,XhoI得酶切位点,并有三个保护碱基,PCR产物的大小为2.1Kb,因为酶切过只有少数几个碱基去掉,所以不知道PCR产物是否被切出粘性末端。我现在该怎么办呀,那一步出问题我都找不到,PCR产物酶切时间是过夜

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见你的问题我就想掉泪,我已做了三个月。我们情况熟悉,互相交流一下,也许大有裨益。有几个建议,1你把PCR后的片段先与T载体相连,然后再做酶切,这样就可以解决你讲的问题。2 PET30a酶切也存在这个问题,你可做单切作对照,若也做不出来,那就只能是连接酶的原因了。3 酶切时间是过夜到不必,切长了反而不好,若你一直这样做,也许问题在这,时间应控制在4小时之内。希望你能把你的感受发出来,互相借鉴。
作者: 森林木    时间: 2011-10-7 17:19

谢谢,我正要重新提取质粒。我做PCR不是用的菌落,是用接种针挑很少的菌落接种LB,培养后取1微升的菌液做为模板进行PCR鉴定的,不知这种情况下的假阳性有多高。以前我转化不成功时PCR基本都是阴性。

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菌落PCR是指直接用菌作摸板,所以你的做法也属于此。假阳性很高,我最初作这个实验,看到这便筛,结果一个也没有。你可以用以前的摸板作对照,扩出的片段亮度应相同,才可以初步确定。
作者: 清风风铃    时间: 2011-10-7 17:20

菌落PCR是指直接用菌作摸板,所以你的做法也属于此。假阳性很高,我最初作这个实验,看到这便筛,结果一个也没有。你可以用以前的摸板作对照,扩出的片段亮度应相同,才可以初步确定。

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我用以前的模板做对照的,我用菌液和提取的质粒做PCR,扩出的片段亮度基本都比我用模板扩出的条带亮度高,有的高很多。
作者: 森林木    时间: 2011-10-7 17:20

那你的PCR在你的转化子里边占多大比例,如果转化成功,这个比例应在90%以上。如果确实,说明你的这一步没问题
作者: 3N4G    时间: 2011-10-7 17:20

我补充一点:
1)lanzr ,调整菌落PCR条件,直接挑转化后的单个菌落放到PCR管中,没必要用LB培养,注意把预变性时间调到7-10分钟,而且挑后沾到含抗性的LB平板上,并做好标记,一次可以挑10来个菌斑。如果还不成功,测序看看!
2)anxueli ,你可以先将纯化的PCR产物克隆到T载体上,酶切后的片段再与你的pET30a(同时双酶切)连接;也可以将PCR产物(如果你的产物特异性强切产量高)双酶切回收,胶回收后直接连到pET30,我建议你先构建好表达载体,转入高拷贝的克隆菌DH5α或JM109效率高,抽提质粒鉴定后再转入BL21。

作者: 森林木    时间: 2011-10-7 17:21

你的意见很好,谢谢你的补充。用DH5a还有一个好处,它的转化率高。
作者: +田田+    时间: 2011-10-7 17:21

目的:酶切后回收目的片断连接
体系: dH2O 41ul
buffer B 5ul
plasmid(100ng/ul) 3ul
Hind 3 0.5ul(5个单位)
Pst I 0.5ul(5个单位)
总体积 50 ul
37度,3个小时,电泳酶切完全,但条带很弱
问题:回收后溶解在25 ul Tris-Hcl中,检测居然没有东西!!!求助,是否因为酶切体系中质粒浓度太低???
曾看到一同学的体系,同样50 ul,plasmid居然加到34 ul!!

作者: 3N4G    时间: 2011-10-7 17:22

载体用的量少了,所以你酶切后的片段条带较弱,而且胶回收的能达到30%就不错了。建议:
1)30ul的体积,质粒的量可以加到1ug,浓度达不到可以先浓缩。双蒸水加少点或不加都没有问题。
2)内切酶用1ul足够。
3)加大上样量,以便能回收较多的目的片段,可以使用宽梳子或将两个梳齿用透明胶连在一起倒胶。
4)回收尽量少切下琼脂糖,回收效率有所增加。
5)回收后跑电泳未见条带,可能是浓度太低,可以先测定OD260看看浓度,如果能达到50ng对后面的实验没有多大影响。

作者: 兔纸    时间: 2011-10-7 17:23

我想请教版主和DX们一个问题,我要把老外给我的pGL-3 Basic质粒MCS上游人工添加的一段调控序列和Tk启动子P下来,替换掉PC-DNA3上的CMV启动子。设计的酶切位点是Nde1和Hind3,其中Hind3本身就位于PGL3 MCS下游,而Nde1则必须加在上游PCR引物的5’端。我查了一下NEB的说明,Nde1的保护序列加上酶本身的序列长达20个bp,加上3’的互补序列一共是30个bp(3’端的十个互补序列是pGL-3上游测序引物的3’端序列距离MCS有40个bp的距离),而下游引物则只有18个bp,不知这样能否P出我要的序列,还是应该不加保护序列,而先克隆到T载体中后在进行下一步的亚克隆,请版主予以指点,谢谢了。
作者: 3N4G    时间: 2011-10-7 17:24

1)Nde1的保护序列加上酶本身的序列,如果是GGAATTCCATATGGAATTCC,只需要加一侧的保护序列就可以了,酶切效率不高,延长酶切时间。
2)两个引物相差太大不大好,一般不超过3个碱基。你可以将下游引物延长点!
3)加保护碱基是为了方便后面的酶切,如果你先克隆到T载体,可以不加!

作者: 小困    时间: 2011-10-7 17:24

还有两个问题想向您请教一下。1、我用TaKaRa公司的Nde1和Hind3同时进行双酶切,用的是该公司提供的通用K Buffer,公司说明书上说在K Buffer中这两种酶的效率都能达到100%,我切了3-4个小时后跑电泳发现没有切开,不知道是时间不够,还是这两种酶最好分开切或是其他什么原因。2、试剂目录上还说,用Nde1酶切后形成的AT粘端在进行连接时,效率很低,要用平末端的连接条件才行。在这种情况下如果将PCR的酶切位点设计为该酶的同尾酶Xsp1来进行连接不知是否效率能有所提高,此方案是否可行,请予以指点,再次感谢!
作者: 3N4G    时间: 2011-10-7 17:25

1)切了3-4个小时没有切开不是时间的问题,如果温度相同可以同时切,换其他公司的酶试一试,或切其它的质粒做对照,也可以用两个酶分别做单酶切对照看看酶有没有问题。
2)平末端连接肯定没有粘末端高,将PCR的酶切位点设计为该酶的同尾酶Xsp1来进行连接,这种方法我没有做过,你可以看看分子克隆。

作者: 椰子叶子    时间: 2011-10-7 17:25

2)连接,第一,在分子克隆上提到,若连接困难,可能末段封闭,因此建议连接之前45度保温5分钟。这一步是否必要。第二,体系(10ul),我一般是凭感觉,若回收的载体中度量(5微生)目的片段微弱,比例如何好。第三,连接酶。我不知到有多长时间了。对照我是否可以用单酶切看连接效果.4)平板经常出问题,有时不长,有时长的不是转化子,问题在于到平板时不能太凉,结果抗生素没混匀。另外,还有一个情况,我前面在做T载体转化时,也是转不出来,是一个老师转的。情况与此差不多。综合这些情况,再请教以下?多劳驾了。

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1。对于第二个问题我觉得没有必要,我一般都没做过这步。

2。pcr产物的量和质粒的量一定要大,如果量少我建议你不要往下做了。这往往是起决定作用的,量大分子发生碰撞的机会才多,才能连上。

3,连接酶很重要,我们实验室用neb的酶,效果很好。

4。平板一定要过关,本人同意版主的意见,最好是新倒的

作者: 扑啦啦    时间: 2011-10-7 17:26

T载体上NdeI 和SalI紧挨着,切这两个酶切位点,连目的片断,就是长不出菌来。会不会是靠的太近切不开,或是更糟,切乱了。请各位大虾多多指教。
作者: 3N4G    时间: 2011-10-7 17:26

一般我们不提倡靠近的两个酶切位点同时切,之间相隔最好3个以上碱基!你切不开是有可能的,建议重新选择酶切位点。  
作者: 森林木    时间: 2011-10-7 17:27

不知怎么了,各种条件都考虑了,酶也换了,就是不出结果。即使有转化子,接菌开始长,变白后就不长了。提一下质粒有三条带,可是一切就碎,真真见鬼了。
作者: 3N4G    时间: 2011-10-7 17:27

可能与甲基化相关!质粒质量不好!  
作者: 森林木    时间: 2011-10-7 17:28

能详细解释一下吗?至于质粒质量不好,我想可能性不大,原质粒(同一批)提取与酶切好好的,再连接转化就不行了。  
作者: 3N4G    时间: 2011-10-7 17:28

具体的我也不清楚,实际上你可以转化其它的宿主菌试一试!再抽提质粒!
作者: 森林木    时间: 2011-10-7 17:28

我已经试了DH5a与JM109,BL21都不行。
作者: HP007    时间: 2011-10-7 17:29

求助:
单酶切产物比未酶切产物跑的快,这种现象应该怎么解释?是酶切没切动,还是其他原因?

作者: 3N4G    时间: 2011-10-7 17:29

单酶切产物如果是一条带,那么就是质粒DNA的分子量,未酶切的产物不好定性!
作者: 生物迷    时间: 2011-10-7 17:30

线状DNA是要比环状DNA跑的快些。环状DNA在胶里可能阻力大些,而且还有不同螺旋。  
作者: #甜#    时间: 2011-10-7 17:30

大家有没有人用过大连宝生物的内切酶,感觉如何呢?
我用了这个公司的内切酶后就是连不上!

作者: 麻瓜    时间: 2011-10-7 17:31

版主好厉害!

小弟偶在做PCR产物 NSP I(NEB)单酶切,不知版主有没有用过这个酶?它的最佳反应温度是37度,我一直用2h,但还没见到有切出特别好的,不知时间是不是要延长?

作者: 3N4G    时间: 2011-10-7 17:32

可以延长酶切时间,过夜!
作者: 麻瓜    时间: 2011-10-7 17:32

酶切时间过长对产物片断会有另外影响吗?
作者: @木木@    时间: 2011-10-7 17:33

载体的量很关键,使用尽量多的载体。
作者: 麻瓜    时间: 2011-10-7 17:33

不知哪位大虾有没有试过在PCR反应液里边直接加内切酶消化呢?
按照NEB说明书“内切酶在PCR反应产物中的活性”是可以的说。

作者: 3N4G    时间: 2011-10-7 17:33

我觉得不很好,PCR反应液里的离子浓度与内切酶是不一样的,而且还有多聚酶的干扰等,建议纯化后再酶切!
作者: dreaming    时间: 2011-10-7 17:34

hi, all,

any comments on the usage of mung bean nuclease are most appreciated.

higher concnetration / longer duration is not so good?!
thanks.

作者: 圆圆圈圈    时间: 2011-10-7 17:34

我也来求教一下我的问题:
我是先用宝生物的NotI和NdeI双酶切PCR产物和pET21b质粒.PCR产物有9个保护碱基, 质粒上的酶切位点也离得足够开了.我的酶系统一般是100ul,两种酶各加10-15U. DNA量小于1ug. 切6个小时. 后来因为一直做不出阳性克隆,也试过单酶切两次. PCR产物先用NdeI 在80ul体系中切2个小时,再加到100ul用NotI切2个小时.质粒切得久一点,分别是4个小时.然后胶回收.用promega的ligase在15ul体系中,放了100ng质粒, 70ngPCR产物, 1U的酶.16度过夜.转化后一个阳性都没有.转化时做了阳性对照, 没有问题.

我想问的是:
1)NotI对甲基化敏感, 我的pET-21b是从DH5a中提的,不知道会不会因为甲基化的关系没有切开?
2)如果没切开,那至少有假阳性克隆啊.但什么都没有.我想是T4 ligase的问题?

请各位不吝赐教! 我是本科生, 实验室中也没有这方面特别牛的师兄师姐.

作者: 小葵    时间: 2011-10-7 17:34

我用salI和BamHI对一个重组子进行双酶切,可我拿到手的酶是不同的公司生产的,且各自buffer的组成相差极大,请问我可以用salI酶切以后,再用酚,氯仿抽提,乙醇沉淀,干燥后用BamHI酶切吗?
作者: 3N4G    时间: 2011-10-7 17:35

我用salI和BamHI对一个重组子进行双酶切,可我拿到手的酶是不同的公司生产的,且各自buffer的组成相差极大,请问我可以用salI酶切以后,再用酚,氯仿抽提,乙醇沉淀,干燥后用BamHI酶切吗?请高手指点

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先切了试试吧,我原来也是用这两个酶的,如果不行,选择比较适中的BUFFER
作者: 3N4G    时间: 2011-10-7 17:35

我也来求教一下我的问题:
我是先用宝生物的NotI和NdeI双酶切PCR产物和pET21b质粒.PCR产物有9个保护碱基, 质粒上的酶切位点也离得足够开了.我的酶系统一般是100ul,两种酶各加10-15U. DNA量小于1ug. 切6个小时. 后来因为一直做不出阳性克隆,也试过单酶切两次. PCR产物先用NdeI 在80ul体系中切2个小时,再加到100ul用NotI切2个小时.质粒切得久一点,分别是4个小时.然后胶回收.用promega的ligase在15ul体系中,放了100ng质粒, 70ngPCR产物, 1U的酶.16度过夜.转化后一个阳性都没有.转化时做了阳性对照, 没有问题.

我想问的是:
1)NotI对甲基化敏感, 我的pET-21b是从DH5a中提的,不知道会不会因为甲基化的关系没有切开?
2)如果没切开,那至少有假阳性克隆啊.但什么都没有.我想是T4 ligase的问题?

请各位不吝赐教! 我是本科生, 实验室中也没有这方面特别牛的师兄师姐.

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放了100ng质粒, 70ngPCR产物, 1U的酶.16度过夜.转化后一个阳性都没有.转化时做了阳性对照, 没有问题.

1)查查相关资料,如果你认为是甲基化问题,用TOP10或JM109转转看!

2)可能是连接和转化的问题,最好先检测一下酶的活性及感受态转化效率,连接体系要注意计算载体与PCR产物的摩尔比,一般1:3,根据需要调整,PCR产物尽量多些。

作者: 幽兰君    时间: 2011-10-7 17:36

兄弟们解决一下我的问题吧!! 好几天都没有人问了。我急了。
我的条带被bamhI 和 PSTI分别酶切后,出现了我的条带消失了,连T载体也被降解了。在marker的最前方有一篇亮带。体系如下:I.pstI 1 ul,10*Hbuffer1ul,DNA 1ul (2ug),ddH20 7ul. II.bamhI 1 ul,10*Kbuffer1ul,DNA 1ul (2ug),ddH20 7ul.反应温度:37度 12小时。时间是长了点可是也不能完全降解呀。我用的实验室的酶PSTI过期了4个月,BAMHI 在用的时候发现结冰了。我现在考虑的问题是1.我用的酶是不是污染了,要不我的条带怎么都降解了呢。再说了按照酶的说明书,酶的稳定性是在12小时孵育DNA是没有发生琼脂糖凝胶电泳的变化的变化的。2.我用的水不应该有问题呀,我用同样的水,酶切同样的载体+我的片断,结果很好。条带清晰。水应该没有问题吧。3.我的酶既然结冰了,是不是有问题呀,一般他们是在甘油里面的呀。-20度是不会结冰的呀。难道我的酶失效了吗。4.再有,我小提的原液也做了对照,很好呀。

作者: 3N4G    时间: 2011-10-7 17:36

1) 质粒抽的不好,重新抽一次
2)先用其他的载体来检测你的酶  

作者: 竹蜻蜓    时间: 2011-10-7 17:37

求助! 我用的是Takara :BamH1和Sal1双酶切,共用buffer是1.5T,但说明书上写两种酶在T buffer中活性均小于20% 且它们还都有*活性。 请问该如何是好?
作者: 如影随形    时间: 2011-10-7 17:37

各位大侠,我想问一下,是否所有的pcr引物都需要保护碱基,引物没有保护碱基能行吗?
作者: @花开花落@    时间: 2011-10-7 17:38

各位大侠,我想问一下,是否所有的pcr引物都需要保护碱基,引物没有保护碱基能行吗?

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in case that u make T/A cloning, blunt end cloning, u dont need 保护碱基
作者: 跳跳糖    时间: 2011-10-7 17:38

请教: 我的1500bp的目的片断经质粒抽提后进行Bamh1和Nde1双酶切,两个小时后检测,目的片断消失,只看到200bp左右的弥散片断,请问出现这样的现象时否因为酶切时间过长,TAKARA公司和MBI的酶我都用过,都是这样的结果。但是转化DH5α菌后再抽提质粒进行酶切,就能切出目的条带,而且是有时能切出条带,有时候检测什么都没有了,请问这是什么原因?非常感谢
作者: 知了知了    时间: 2011-10-7 17:40

各位请问一下灭活内切酶的温度要求是多少?
作者: 庄梦蝶    时间: 2011-10-7 17:40

我想问个问题:我做酶切连接老是不成功.
 我的PCR产物是用胶回收的,回收完,估量后,酶切,20微升体系,400ng的DNA,0.5微升的NCO I ,切2.5小时! 酶失活后,用乙醇沉淀后,再用0.5微生Sal I 切2.5小时,也是20微升体系! 最后胶回收酶切PCR产物与同样的方法酶切载体一起电泳,估量,16度14小时连接.转化只有10个左右,
 不知各位高手能不能给点建议,帮我改进一下,让转化率高一些!
  谢谢!

作者: tears    时间: 2011-10-7 17:41

请教高手,我的PCR产物酶切过夜后用琼脂检测就什么都看不到了,酶切3个小时还能检测到产物,4个小时就什么都检测不到了更别提过夜了,请问这是为什么啊?是酶的活性问题还是PCR产物的问题啊?  
作者: wawa    时间: 2011-10-7 17:41

我想问各位高手:用Hpa I和Nco I(均为大连宝生物的)进行双酶切时,可否同时切,它们没有共BUFFER,但Hpa I的BUFFER是K,Nco I的BUFFER是K加BSA,而且反应温度都是37。还有如果是不能,需要一个一个切的话,应先切那个呢?切完应如何进行乙醇沉淀纯化呢?具体是怎么操作呢?谢谢指点!
作者: 森林木    时间: 2011-10-7 17:42

BUFFERK加BSA切
作者: 锤子    时间: 2011-10-7 17:42

我是标准的新手 大家一定要多指点啊 呵 我好不容易要了一个带目的基因的质粒 可是没有构建图 请问怎么办啊 设计引物PCR拉出来吗? 目的基因差不多2KB ,还是用最外边的酶切?都有什么好办法啊 我现在不知从哪下手阿 各位大侠帮忙啦




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