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标题: 【求助】PCR产物的电泳结果目的条带很暗，一点也不亮... [打印本页]

作者: 蒲公英 时间: 2015-12-30 11:45 标题: 【求助】PCR产物的电泳结果目的条带很暗，一点也不亮...

各位，我两次PCR产物的电泳结果目的条带很暗，一点也不亮是怎么回事。模板是1ul，体系25ul。电泳上样量是PCR产物6.5ul，6×buffer1.5ul，制胶时用的是八孔的梳子（北京六一的第二小的梳子，还有11孔的）！

作者: 蒲公英 时间: 2015-12-30 11:46

晕了，不会把，我以前也是用同样的方法，同样的体系，作出来效果不错阿，现在不只怎么回事，帮帮忙啊！！！

作者: zhenxin 时间: 2015-12-30 11:46

4楼
胶是不是旧了?

作者: 911 时间: 2015-12-30 11:47

我的模板为2ul, 体系20ul都还暗呢, 建议你
1、增加模板量
2、检查引物是否有问题
3、使用合适的buffer
4、体系各组分含量做一个梯度对比一下

作者: jude 时间: 2015-12-30 11:47

胶是不是旧了?

作者: moonlight 时间: 2015-12-30 11:49

是不是你的模板降解了，建议加大模板量试试。如果条带比较干净，没有非特异的扩增，可以试着增加cycles。不知道你的PCR程序是什么，可以试着调整延伸时间，都可以增加产量。

作者: 蒲公英 时间: 2015-12-30 11:49

我的PCR体系是：
10×PCR Buffer 2.5μl
DNTP 2ul
上流引物 (10 pmol/μl) 1μl
下流引物(10 pmol/μl) 1μl
taq酶 0.125ul
cDNA 1ul
灭菌蒸馏水to 25ul
94℃ 3min
94℃ 30s
55℃ 40s
72℃ 40s
72℃ 10min
4℃ for ever
35个循环

作者: pore 时间: 2015-12-30 11:49

1、确定模板没有问题，可以单独对模板进行电泳。
2、引物是否合成时间太久，怎么贮存的，如果不是新合成的，或者不是新鲜稀释的也会出现这种情况。
3、扩增片段有多长，可以适当增加延伸时间。
4、循环次数应该足够了。
5、Taq是国产的还是进口的，最好用进口的，或者可以换用PFU试试。
6、不要泄气，不断改变条件，也可以再讨论。我当时摸索着做了半年的PCR呢呵呵，望对你有所帮助。

作者: 蒲公英 时间: 2015-12-30 11:50

谢谢！现就你所提的问题做以下解释：
1. 模板我没用跑电泳，不知道有没有问题。我用同样的条件曾经跑出来的电泳很亮，但是后来有重新反转录的，有一次的也挺好。
2.引物是刚合成的有一个月吧，-20℃储存。
3.目的片断550bp，延伸时间应该够了吧。
4.Taq是TAKARA的应该也没有问题吧。
如果要优化PCR条件，具体优化那些，怎样优化？

作者: koook5695 时间: 2015-12-30 11:50

TAKARA的酶是新的吗？有段时间我们买的TAKARA的酶用过几次后，扩增效率就特别低，目的条带特别淡。换了个酶就很好了。

作者: 蒲公英 时间: 2015-12-30 11:50

也就一个月吧，应该不会吧
是不是模板少了！！

作者: sunbent 时间: 2015-12-30 11:51

你用那个公司反转录的cDNA，我觉得你的cDNA加的有点少。通常用上海生工MMLV反转录的要加2ul左右，用promega的AMV或MMLV的都加2－3ul，当然如果你要是用invitrogen的superscript，可以少加点。我通常反转录时取1ugRNA的量去做反转录，之后25ulPCR体系模板量都是按照上面所说的加的。说句题外话，invitrogen的就是好，我通常25ul体系，模板就加0.2-0.5ul都可以。

作者: 蒲公英 时间: 2015-12-30 11:51

我两个月以前的PCR产物，现在跑电容什么都没有，什么原因？讲解了？？

作者: woshi 时间: 2015-12-30 11:51

做一下酶梯度，看是不是酶的用量太少了

作者: ujne 时间: 2015-12-30 11:52

我的PCR体系是：
2×PCR MASTER MIX 25μl
上流引物 (10 pmol/μl) 1.25μl
下流引物(10 pmol/μl) 1.25μl
cDNA 2.5ul
灭菌蒸馏水to50μl
94℃ 4min
94℃ 30s
55℃ 40s
72℃ 90s
72℃ 7min
4℃ for ever
35个循
此条件下做胶回收第一天有目的条带但是很暗，第二天未见目的条带求解这是什么原因

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