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标题: 【求助】为什么不能提取DNA直接进行PCR？ [打印本页]

作者: H2O 时间: 2015-12-30 17:20 标题: 【求助】为什么不能提取DNA直接进行PCR？

我是第一次接触PCR实验，PCR的模板是经逆转录生成的cDNA，请问为什么不能直接提取DNA进行直接进行PCR反应呢？

作者: yhz1973 时间: 2015-12-30 17:21

因为你是做基因的mRNA表达水平的变化，所以一定是要从mRNA的水平出发（DNA和转录后的mRNA是不一样的，DNA含有内含子，mRNA不含有，因为在转录过程中内含子被剪切掉了），但又由于RNA比较不稳定，所以通常都是逆转录成cDNA再做PCR。

作者: rfv 时间: 2015-12-30 17:21

很多战友都是“过来人”了，在菜鸟时代也曾有过现在看起来非常低级的失误，也曾有很多疑惑希望有经验的老同志给以指导，将心比心吧，人家虚心问，老同志也稍微注意一下言辞虚心作答，要不然人家的虚心就变成心虚了，兴许人家一直在搞药学研究，偶尔需要做点基因表达的东西，基础自然会薄弱些。
以上纯属灌水，见谅。
以下说说楼主的问题，我也尽量说得简明易懂些，当然表述上可能就不是那么严密了。
楼主要先明白基因，mRNA，cDNA是啥关系。
基因转录得到了mRNA，mRNA逆转录得到了cDNA
你的目的基因在基因组中的拷贝数（很多基因在基因组中只有单独的一条，但也有多条相同基因共同存在于基因组的情况，这个1条或n条的数就是拷贝数了）是一定的，你加药不加药，这个拷贝数都不会变了，所以如果你直接提取基因组DNA，那么无论怎么做PCR，也不会有差异了。
但是cDNA与基因组DNA不同，我们提取mRNA，然后用逆转录酶把mRNA变成cDNA，这样cDNA和mRNA之间就存在着等比的关系，我们用实时定量PCR或者半定量PCR检测cDNA的多少，也就相当于检测mRNA的多少，这样才能比较出你要研究的目的基因的mRNA的表达水平。
希望这些对楼主能有帮助，的确如有些战友所言，如果楼主以后要经常从事分子生物学研究的话，最好还是找机会听些课，看点书籍，多和老同志聊聊，肯定是有裨益的，祝你顺利。

作者: rfv 时间: 2015-12-30 17:23

呵呵！你没告诉我们你的目的是什么，所以不好说，
如果从基因克隆的角度来说，DNA和cDNA都可以的，但是DNA包含有内含子，片段通常比较长。

作者: H2O 时间: 2015-12-30 17:23

我的目的不是基因克隆，是检测药物作用下基因的mRNA表达水平的变化情况。

作者: c86v 时间: 2015-12-30 17:23

cDNA是由mRNA逆转而来的，反应的是基因表达量。
你提DNA，是为了干什么？做遗传学研究？
一个基因，一般来说每个人都是有的，肯定都能P出来，除非你是做SNP检测。
你搞不清楚要以哪个为模板，说明你最基本的RNA和DNA代表什么都不知道。
建议先去看生化书，这里不详细解释了。这样对你自己有帮助。
顺便问一下，楼主是本科生还是硕士生？

作者: loli 时间: 2015-12-30 17:24

我没有半点取笑楼主的意思
你的前半句是灌水，后半句纯粹是广告，已经在很多贴中看到你的广告了。
如果你真的做SNP，有成果和经验，不妨直接贴出来，视贡献，版主还能给你加点分。我们也会投票给你，如果只是为了广告而发贴，我建议版主K杀之。

作者: ffaa 时间: 2015-12-30 17:24

本人做SNP的有些成果和经验，需要的朋友联系我 andoneyan6391960@163.com
我没有半点取笑楼主的意思
你的前半句是灌水，后半句纯粹是广告，已经在很多贴中看到你的广告了。
如果你真的做SNP，有成果和经验，不妨直接贴出来，视贡献，版主还能给你加点分。我们也会投票给你，如果只是为了广告而发贴，我建议版主K杀之。
人家就算做广告也没有留什么公司名或者什么价格和你有屁事呀，况且人家留下信息是和别人讨论相关的知识，也不会抢钱的，你管的着吗？没有事管好自己吧

作者: sunnyB 时间: 2015-12-30 17:24

很多战友都是“过来人”了，在菜鸟时代也曾有过现在看起来非常低级的失误，也曾有很多疑惑希望有经验的老同志给以指导，将心比心吧，人家虚心问，老同志也稍微注意一下言辞虚心作答，要不然人家的虚心就变成心虚了，兴许人家一直在搞药学研究，偶尔需要做点基因表达的东西，基础自然会薄弱些。
以上纯属灌水，见谅。
以下说说楼主的问题，我也尽量说得简明易懂些，当然表述上可能就不是那么严密了。
楼主要先明白基因，mRNA，cDNA是啥关系。
基因转录得到了mRNA，mRNA逆转录得到了cDNA
你的目的基因在基因组中的拷贝数（很多基因在基因组中只有单独的一条，但也有多条相同基因共同存在于基因组的情况，这个1条或n条的数就是拷贝数了）是一定的，你加药不加药，这个拷贝数都不会变了，所以如果你直接提取基因组DNA，那么无论怎么做PCR，也不会有差异了。
但是cDNA与基因组DNA不同，我们提取mRNA，然后用逆转录酶把mRNA变成cDNA，这样cDNA和mRNA之间就存在着等比的关系，我们用实时定量PCR或者半定量PCR检测cDNA的多少，也就相当于检测mRNA的多少，这样才能比较出你要研究的目的基因的mRNA的表达水平。
希望这些对楼主能有帮助，的确如有些战友所言，如果楼主以后要经常从事分子生物学研究的话，最好还是找机会听些课，看点书籍，多和老同志聊聊，肯定是有裨益的，祝你顺利。

作者: wawa 时间: 2015-12-30 17:25

我们都是从不懂走过来的，无论是什么原因，发帖的人有不明白的，我建议：能答就答一句实实在在的答案，别管人家问的问题水平高低。
对于回答问题的人：别说什么看书找答案，如果这么说的话，那什么问题都能去看书找答案了。
对于问问题的人：请先搜索一下过往的帖子或百度一下，尽量自己废点时间也别浪费大家时间，谁让咱是不会的人呢。

作者: caihong 时间: 2015-12-31 11:19

如楼上曾经的老大叔所说，我们新来人的确有许多知识不是很了解，有时说话冲动提问有点幼稚，希望各位“前辈”能够谅解

作者: taoshengyijiu 时间: 2015-12-31 11:19

闻道有先后，术业有专攻，如是而已。
每个人都有自己强项，也有自己的不足，看到别人在自己的专长领域有疑惑，个人觉得还是力所能及的回答一下，哪怕问题再低级幼稚，谁不是从这个阶段过来的呢？
高手不要拍砖，这是我的一点想法。有时看到一些挖苦的话，不怎么舒服。

作者: 7437654 时间: 2015-12-31 11:19

因为你是做基因的mRNA表达水平的变化，所以一定是要从mRNA的水平出发（DNA和转录后的mRNA是不一样的，DNA含有内含子，mRNA不含有，因为在转录过程中内含子被剪切掉了），但又由于RNA比较不稳定，所以通常都是逆转录成cDNA再做PCR。

作者: moonlight 时间: 2015-12-31 11:19

如果是要检测基因表达水平，似乎需要做Real-time PCR来检测吧？！单纯的RT-PCR扩增基因好像不能说明什么问题。

作者: 3N4G 时间: 2015-12-31 11:20

做PCR靠自己一步一步去摸索其实很不划算，最好能找个比较懂的人教下你，因为其中有的东西是很简单的，但自己要是不知道的话就要费很多时间去找寻答案以及理解，我本来也不是这个领域的，后来在一个很厉害的师兄带领下，很快就能掌握大概了。

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